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環境汚染物質やシグナル伝達物質を分解する酸素添加酵素の設計原理解明と指向進化

研究課題

研究課題/領域番号 13125202
研究種目

特定領域研究

配分区分補助金
審査区分 理工系
研究機関滋賀医科大学

研究代表者

堀池 喜八郎  滋賀医科大学, 医学部, 教授 (80089870)

研究分担者 木村 隆英  滋賀医科大学, 医学部, 教授 (70167378)
田中 裕之  滋賀医科大学, 医学部, 助手 (10293820)
石田 哲夫  滋賀医科大学, 医学部, 助教授 (10176191)
喜田 昭子  京都大学, 大学院・理学研究科, 助手 (70273430)
研究期間 (年度) 2001 – 2003
研究課題ステータス 完了 (2003年度)
配分額 *注記
31,100千円 (直接経費: 31,100千円)
2003年度: 7,700千円 (直接経費: 7,700千円)
2002年度: 7,700千円 (直接経費: 7,700千円)
2001年度: 15,700千円 (直接経費: 15,700千円)
キーワード酸素添加酵素 / 酵素反応機構 / 非ヘム鉄 / カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ / カテコール / 酸素活性化 / 置換基効果 / ホモプロトカテク酸 / 結晶構造 / 2,3-ジヒドロキシビフェニール / 電荷移動錯体 / ニトロフェノール / 酵素添加酵素 / カテコール2,3-ジオキゲナーゼ / 酸素分子
研究概要

1.好熱菌Thermus Thermomophilus HB8のホモプロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼ(HPCD)の結晶構造とその触媒機能および物理化学的性質を明らかにした。
2.カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ(Mpc)と2,3-ジヒドロキシビフェニール1,2-ジオキシゲナーゼ(BphC)の詳細な反応動力学と結合実験を行い、関連パラメータを精密測定した。これらの結果と結晶構造の比較から、C3置換基と活性部位タンパク質側鎖との相互作用が、BphCではEA複合体形成を助け、Mpcでは基質の解離促進に働くことが分かった。
3.Mpcの活性部位への基質結合速度は置換基の電子吸引性と負の相関を示すこと・EA複合体の安定性は置換基の立体的な効果を受けること・フェノール誘導体(拮抗阻害剤)とのEI複合体の安定性は置換基の電子吸引性と正の相関を示すことを明らかにした。これらの結果から、酵素へのカテコールの結合はEI複合体類似の1座配位中間体を経る多段階反応であるという仮説が得られた。
4.MpcのEA複合体への酸素分子の結合・活性化速度が基質置換基の電子吸引性と負の相関を示すことを示し、カテコールから酸素分子への1電子移動が酸素活性化に重要であることを証明した。Mpcの酸素結合部位は、カテコール環とHis199,A202,Leu155,Phe191で構成され、BphCではロイシンがバリンに代わり疎水性ポケットが広くなり、HPCDではロイシンがアスパラギンに代わり疎水性が部分的に壊されていることが分かった。これらの結果から、各酵素の酸素分子との反応性の特徴が構造からはじめて説明できた。
5.C4置換カテコールはBphCの基質にならず、酸素依存性にBphCを失活させることを発見した。構造解析からC4置換カテコールが基質とは異なる仕方で鉄イオンに2座配位することが分かった。これらの結果から、基質による自殺反応の反応機構の仮説(活性中心鉄イオンは2価から3価に酸化、酸素分子は0_2^-として遊離)が得られた。
本研究で、extradiol型酸素添加酵素の基質認識機構と酸素分子の結合・活性化の設計原理がほぼ明らかになり、合理的に指向進化させる基礎が得られた。

報告書

(4件)
  • 2003 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2002 実績報告書
  • 2001 実績報告書
  • 研究成果

    (14件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (14件)

  • [文献書誌] Tetsuo Ishida: "Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol Dioxygenases with broad substrate specificity"J.Biochem.. (印刷中). (2004)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 石田哲夫: "非ヘム2価鉄イオン単核錯体を利用する酵素群:2-His-1-Carboxylate酵素のO_2を利用した多彩な反応"化学と生物. (印刷中). (2004)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Tetsuo Ishida: "Structure and reaction mechanism of catechol 2,3-dioxygenase (metapyrocatechase)"International Congress Series. 1233. 213-220 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hirofumi Nakajima: "Accurate measurement of near-micromolar oxygen concentrations in aqueous solutions based on enzymatic extradiol cleavage of 4-chlorocatechol : applications to improved low-oxygen experimental systems and quantitative assessment of back diffusion of oxygen from the atmosphere"J.Biochem.. 131. 523-531 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] H.Nakajima, T.Ishida, H.Tanaka, K.Horiike: "Accurate measurement of near-micromolar oxygen concentrations in aqueous solutions based on enzymatic extradiol cleavage of 4-chlorocatechol : applications to improved low-oxygen experimental systems and quantitative assessment of back diffusion of oxygen from the atmosphere."J. Biochem.. 131. 523-531 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Ishida, A.Kita, K.Miki, M.Nozaki, K.Horiike: "Structure and reaction mechanism of catechol 2,3-dioxygenase (metapyrocatechase)."International Congress Series. 1233. 213-220 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] T.Ishida, H.Tanaka, K.Horiike: "Quantitative structure-activity relationship for the cleavage of C3/C4-substituted catechols by a prototypal extradiol catechol dioxygenases with broad substrate specificity."J. Biochem.. (in press).

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2003 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hirofumi Nakajima: "Accurate measurement of near-micromolar oxygen concentrations in aquious solutions based on enzymatic extradiol cleavage of 4-chlorocatechol : Applications to improved low-oxygen experimental systems and quantitative assessment of back diffusion of oxygen from the atmosphere"J. Biochem.. 131. 523-531 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Tetsuo Ishida: "Structure and reaction mechanism of catechol 2,3-dioxygenase"Excerpta Medica ICS. 863(印刷中). (2003)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Hirofumi Nakajima: "Accurate measurement of near-micromolar oxygen concentrations in aqueous solutions based on enzymatic extradiol cleavage of 4-chlorocatechol : applications for improved low-oxygen experimental systems and quantitative assessment of the back diffusion of oxygen from the atmosphere"J. Biochem.. (印刷中). (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Tetsuo Ishida: "Structure and reaction mechanism of catechol2,3-dioxygenase"Excerpta Medica ICS. 863(印刷中). (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Osamu Sawada: "Frontal gel chromatographic analysis of the interaction of a protein with self-associating ligands : aberrant saturation in the binding of flavins to bovine serum albumin"J. Biochem.. 129. 899-907 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Kihachiro Horiike: "Distribution of D-amino-acid oxidase and D-serine in vertebrate brains"J. Mol. Catal.. 12B. 37-41 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Hisashi Yoshioka: "Spin-trapping study on the hydroxyl radical formed from a tea catechin-Cu(II) system"Biosci. Biotech. Biochem.. 65. 1697-1706 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書

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公開日: 2001-04-01   更新日: 2018-03-28  

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