| 研究課題/領域番号 |
13132204
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| 研究種目 |
特定領域研究
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
理工系
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
小宮山 真 東京大学, 先端科学技術研究センター, 教授 (50133096)
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| 研究分担者 |
浅沼 浩之 東京大学, 先端科学技術研究センター, 助教授 (20282577)
須磨岡 淳 東京大学, 大学院工学系研究科, 助手 (10280934)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2004
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| 研究課題ステータス |
完了 (2004年度)
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| 配分額 *注記 |
115,700千円 (直接経費: 115,700千円)
2004年度: 17,300千円 (直接経費: 17,300千円)
2003年度: 18,100千円 (直接経費: 18,100千円)
2002年度: 38,300千円 (直接経費: 38,300千円)
2001年度: 42,000千円 (直接経費: 42,000千円)
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| キーワード | DNA / 人工制限酵素 / リン酸ジエステル / RNA / ペプチド核酸 / セリウム / 加水分解 / アクリジン / PNA / リン酸エステル / 制限酵素 / 機能性核酸 / バイオテクノロジー / 遺伝子操作 |
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| 研究概要 |
本研究により、DNAおよびRNAの選択的に切断する手法の開発に成功した。
1.DNA切断
相補鎖DNAを用いて基質一本鎖DNAにギャップ構造を形成させ、ここにCe(IV)/EDTAを加えると、ギャップ部位での選択的切断が実現することを明らかにした。さらに、相補鎖DNAの末端をリン酸修飾することにより、ギャップでの切断効率が大きく向上することを見出した。
二本鎖DNAに対してPseudo-complementary PNA (pcPNA)をstrand invasionすることにより基質DNA中に部分的に一本鎖部位を形成させ、ここにCe(IV)/EDTAを加えるとそれぞれの鎖の一本鎖部分での選択的な切断が実現し、結果として二本鎖DNAが塩基配列特異的に切断されることを見出した。さらに、strand invasionさせるpcPNAの末端をリン酸やアミノポリカルボン酸などの配位子で修飾することにより、切断効率が大きく向上することを明らかにした。また、我々の見出した人工制限酵素系によって切断されたDNAは、天然酵素を用いて切断断片と外来DNAを再結合することが可能であり、組換えDNAを調製することにも成功した。
2.RNA切断
アクリジンをインターカレーターとしてDNA鎖に導入し、相補的RNAと二本鎖形成させることにより基質RNA中のアクリジンの正面が位置選択的に活性化され、ここに希土類イオンを加えると活性化された部分のみが選択的に切断されるごとを見出した。また、この方法を利用し、RNA中の目的領域を挟むようにDNA鎖に2つのアクリジンを導入し、目的のRNA断片を切り出すことにも成功した。さらに、切断した断片をMALDI-TOF-MSにより質量解析することで、精密かつ高速な一塩基多型の検出法の開発に目途をつけた。
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