研究課題
特定領域研究
院内感染の主要起因菌である緑膿菌は3成分から成る薬剤排出トランスポーターを発現する事によって多剤耐性となる。そこでこのトランスポーターの性質を明らかとすべく次のような研究を行った。(i)MexAB-OprMトランスポーターサブユニットの結晶構造解析:MexA,MexB,OprMを各々に結晶化し、その構造解析を行った。MexAは細長い蛋白質で主として4個のドメイインから成っており、OprMとMexBを連結する構造である事が明らかとなった。OprMは外膜を貫通し、ペリプラズムに大きく突出した構造を有しており中には大きな空洞が存在した。しかしその外膜側の端は極度に狭く、またペリプラズム側の先端は完全に閉塞状態でありこの空洞を抗生物質が透過する事は可能でないと解釈した。(ii)トランスポーターの基質認識部位:3成分トランスポーターの基質認識部位を、βラクタムを選択するMexBとアミノグリコシドを認識するMexYのキメラ蛋白を構築し特定化した。その結果基質は膜貫通ドメインではなくペリプラズムドメインで認識される事が明らかとなった。(iii)MexAB-OprM及びMexXYトランスポーターの発現調節:各々の発現調節因子MexR及びMexZを精製し各々のオペレーター・プロモーターDNAとの結合実験を行った結果、各々のオペロンの発現調節の機序が明らかとなった。(iv)3成分トランスポーターのアッセンブリー機序:3成分のうち一つのサブユニットのみを標識し、他の2成分を釣り上げる方法により3成分が細胞膜内で相互に結合している事を確認した。またMexAとOprMの相互作用部位は各々のαヘリックス部位である事を遺伝的な実験により証明した。(v)MexB及びMexYの大量発現系の構築:これらのトランスポーターの大量発現は菌にとって致死的である。そこでこれらに種々の遺伝的操作を加え、また発現に用いる宿主を選ぶ事によって野生株に較べ50-100倍の発現を可能とした。その他の研究結果も含め多くの成果を得る事ができた。
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