| 研究概要 |
【研究目的】病原性結核菌強毒株M.tuberculosis H37Rvの全ゲノムの塩基配列が決定されたが、この株は転写開始因子(シグマ因子)が異なる13種のRNAポリメラーゼをもつなど複雑な転写様式をもつ。本研究の目的は、再興感染症の一つの原因菌であり、取り扱いが危険なこの結核菌強毒株のプロモーターを、生化学とバイオインフォーマティックスとを総合的に利用することにより、実用的で危険の無い固定化酵素を用いた新手法で探索することである。この研究で得られる結果は結核菌の転写機構の一般的な理解のみに止まらず、現在まだ不明である病原性にかかわる遺伝子の転写機構を明らかにして感染症の制御やワクチン開発の基盤をあたえる意義をもつと同時に、本研究の新手法は他の病原性バクテリアにそのまま利用できる一般性をもつものである。
【研究実績】大腸菌多量発現系を用いてM. tuberculosisの異なるシグマ因子をもつ8種のリコンビナントホロ酵素をそれぞれ精製し、開発した固定化樹脂を用いて、結核菌の13種のうち8種の固定化ホロ酵素(sigA, sigB, SigC, sigD, sigE, SigG, SigH, sigI型)を調製した。
ゲノムでの出現頻度から設計されたプライマーを用いたPCRによって構築したM. tuberculosisゲノムライブラリー(前年度構築済)から、それぞれの固定化ホロ酵素に高い親和性をもち、かつ1サイクルの転写に伴って解離されるDNA断片を選択した。次に、選択されたDNA断片の塩基配列を決定したのち、シグマ型ごとにプロモーター配列を整列し、各々の共通性を探った。その結果、sigA, sigE, sigH型のプロモーターDNA断片を収集した。
その結果、sigA型(major RNA polymerase)プロモーターは大腸菌のシグマ70型プロモーター共通配列(TTGACA<16/17/bp>TATAAT)と類似したもの、-10配列のみが類似のもの及び類似していないものが得られた。また、sigH型(EcF RNA polymerase)のプロモーターは、ECF型プロモーター共通配列(CCGGAACTT<16/17/bp>TCTgA)の-35領域が保存されていた。一方、SigE型のプロモーターもECF型であるが、その共通配列と類似性はなく、共通配列はGG^<aa>_<gc>(C/A)<18bp>^c_gGTT^g_cと推定される。
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