| 研究課題/領域番号 |
13216067
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| 研究種目 |
特定領域研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 審査区分 |
生物系
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
佐甲 靖志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (20215700)
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| 研究期間 (年度) |
2001
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| 研究課題ステータス |
完了 (2001年度)
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| 配分額 *注記 |
4,600千円 (直接経費: 4,600千円)
2001年度: 4,600千円 (直接経費: 4,600千円)
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| キーワード | 全反射蛍光顕微鏡 / セミ・インタクト細胞 / 自己リン酸化 / SH2ドメイン / Grb2 / Shc |
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| 研究概要 |
上皮成長因子(EGF)による細胞増殖のための細胞内情報伝達系の働きを、細胞内で1分子計測し、解析することにより、増殖信号の伝達機構を解明することを目的として研究を行った。
蛍光標識した情報分子や活性化型情報分子を認識する抗体を、対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞内蛍光1分子イメージング法で検出した。異なった蛍光色素で2種の分子を標識して同時観察することにより、分子の活性化や分子間相互作用を1分子計測した。
(1)EGF受容体の自己リン酸化反応の1分子可視化: EGF受容体はEGFの結合によって活性化し自己リン酸化する。EGFを蛍光色素Cy3で、リン酸化した受容体を特異的に認識する抗体(mAb74)のFab'断片を蛍光色素Alexa488でそれぞれ標識した。SLOで細胞膜に穴を開けたA431細胞にCy3-EGFを結合させ、過剰なCy3-EGFを洗い流すとともに、Alexa-Fab'を加えて平衡化させ、ATPを加えてリン酸化反応を開始させた。Cy3とAlexaの輝点の局在を比較することにより、リン酸化部位を1分子検出できた。EGF受容体はEGFの結合以前からクラスターを作っているが、EGFの結合した受容体を含むクラスター内でEGFの結合していない受容体にもリン酸化が進行することが分かった。同時に、活性化受容体の部位数もEGF結合部位数より多くなることが分かった。
(2)EGF受容体とSH2蛋白質の相互作用の1分子可視化:自己リン酸化したEGF受容体は多種のSH2蛋白質に認識される。Grb2全長およびShcのSH2ドメインををCy3で蛍光標識・精製し、正常なリン酸化EGF受容体認識能をもつことを確認した。リン酸化反応の検出と同様にSLOで処理した細胞で、蛍光色素Cy5で標識したEGF結合部位でCy3-SH2が結合・解離を繰り返す様子が観察された。Shcの解離速度は0.1/sのオーダーで、in vitroで生化学的に求められた報告値にほぼ一致したが、結合速度が10倍程度速いという結果を得た。細胞膜における受容体の高次構造形成や、蛋白質分子のヒステリシスによる多層的な反応性によるものと考えられる。
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