キメラRNA/DNAを用いたDuchenne型筋ジストロフィーの治療に関する研究

• 研究課題/領域番号: 13307026
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 小児科学
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 松尾 雅文 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (10157266)
• 研究分担者: 八木 麻里子 (八木 麻理子) 神戸大学, 医学部付属病院, 助手 (60362787) ; 竹島 泰弘 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (40281141)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 55,120千円 (直接経費: 42,400千円、間接経費: 12,720千円); 2003年度: 16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円); 2002年度: 16,120千円 (直接経費: 12,400千円、間接経費: 3,720千円); 2001年度: 22,880千円 (直接経費: 17,600千円、間接経費: 5,280千円)
• キーワード: ジストロフィン / Duchenne型 / 筋ジストロフィー / 分子治療 / 遺伝子異常 / デュシェンヌ型筋ジストロフィー / キメラRNA / DNA / 点変異 / 筋細胞 / 治療 / 点突然変異

研究概要

本研究ではRNA/ENAキメラを用いてジストロフィン遺伝子のエクソン41のスキッピングを誘導するDuchenne型筋ジストロフィー(DMD)の治療法について検討した。DMD患者でエクソン41に点突然変異によりナンセンス変異を有する例を治療対象とした。エクソン41は183塩基で、本エクソンがmRNAからなくなればナンセンスコドンがなくなるとともに残るmRNAのアミノ酸読み取り枠が回復されることになる。その結果、ジストロフィンの産生が回復することが期待される。
そこで、RNA/ENAキメラを用いてエクソン41のスキッピング誘導を検討した。エクソン41の配列全体をカバーする様に18マーからなるRNA/ENAキメラを多数合成した。そして、それぞれを培養筋細胞に導入し各RNA/ENAキメラのもつエクソン41スキッピング誘導能をジストロフィンmRNAをRT-PCRを解析することにより判定した。その結果、1つのRNA/ENAキメラが最も強くエクソン41のスキッピングを誘導することを明らかにした。
さらに、エクソン41にナンセンス変異を有する患者から樹立した培養筋細胞にこのRNA/ENAキメラを導入した。導入後ジストロフィンmRNAをRT-PCR解析したところ、エクソン41がスキップしたmRNAが90%近く得られた。導入した筋細胞をジストロフィン染色したところ、90%の筋細胞でジストロフィンが陽性になることが確認された。
以上の結果RNA/ENAキメラがエクソンスキッピングを極めて有効に誘導することが判明し、今後治療への応用が大きく期待されるところとなった。

研究成果

• [文献書誌] Yagi M: "Two alternative exons can result from activation of the cryptic splice acceptor site deep within intron 2 of the dystrophin gene in a patient with as yet asymptomatic dystrophinopathy"Hum.Gemet.. 112. 164-170 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ito T: "Analysis of dystrophin mRNA from skeletal muscle but not from lymphocytes led to identification of a novel nonsense mutation in a carrier of Duchenne muscular dystrophy"J.Neurol. 250. 581-587 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Adachi K: "Heterogpus dystrophin mRNAs produced by a novel splice acceptor site mutation in intermediate dystrophinopathy"Ped.Res.. 53. 1-7 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Masafumi M: "Treatment of Duchenne muscular dystrophy with oligonucleotides against an exonic splicing enhancer sequence"Basic and Applied Myology. (in press). (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nakayama Y: "Cloning of cDNA encoding a regeneration-associated muscle protease whose expression is attenuated in cell lines derived from Duchenne muscular dystrophy patients"American Journal of Pathology. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yagi M, Takeshima Y, Wada H, Nakamura H, Matsuo M.: "Two alternative exons can result from activation of the cryptic splice acceptor site deep within intron 2 of the dystrophin gene in a patient with as yet asymptomatic dystrophinopathy."Hum.Genet.. 112. 164-170 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ito T, Takeshima Y, Yagi M, Kamei S, Wada H, Matsuo M.: "Analysis of dystrophin mRNA from skeletal muscle but not from lymphocytes led to identification of a novel nonsense mutation in a carrier of Duchenne muscular dystrophy."J.Neurol.. 250. 581-587 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Adachi K, Takeshima Y, Wada H, Yagi Y, Nakamura H, Matsuo M.: "Hetergpus dystrophin mRNAs produced by a novel splice acceptor site mutation in intermediate dystrophinopathy."Ped.Res.. 53. 1-7 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Matsuo M, Yagi M, Takeshima Y.: "Treatment of Duchenne muscular dystrophy with oligonucleotides against an exonic splicing enhancer sequence."Basic and Applied Myology. (in press). (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nakayama Y, Nara N, Kawakita Y, Takeshima Y, Arakawa M, Katoh M, Morita S, Iwatsuki K, Tanaka K, Okamoto S, Kitamura T, Seki N, Matsuda R, Matsuo M, Saito K, Hara T.: "Cloning of cDNA Encoding a Regeneration-associated Muscle Protease Whose Expression is Attenuated in Cell Lines Derived from Duchenne Muscular Dystrophy Patients"American Journal of Pathology. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yagi M: "Two alternative exons can result from activation of the cryptic splice acceptor site deep within intron 2 of the dystrophin gene in a patient with as yet asymptomatic dystrophinopathy"Hum.Gemet.. 112. 164-170 (2003)
• [文献書誌] Ito T: "Analysis of dystrophin mRNA from skeletal muscle but not from lymphocytes led to identification of a novel nonsense mutation in a carrier of Duchenne muscular dystrophy"J.Neurol. 250. 581-587 (2003)
• [文献書誌] Adachi K: "Hetergpus dystrophin mRNAs produced by a novel splice acceptor site mutation in intermediate dystrophinopathy"Ped.Res.. 53. 1-7 (2003)
• [文献書誌] Masafumi M: "Treatment of Duchenne muscular dystrophy with oligonucleotides against an exonic splicing enhancer sequence"Basic and Applied Myology. in press. (2003)
• [文献書誌] Nakayama Y: "Cloning of cDNA Encoding a Regeneration-associated Muscle Protease Whose Expression is Attenuated in Cell Lines Derived from Duchenne Muscular Dystrophy Patients"American Journal of Pathology. in press. (2004)
• [文献書誌] Saito-Ohara F, Fukuda Y, Ito M, Agarwala K, Hayashi M, Matsuo M, Imoto I, Yamakawa K, Nakamura Y, Inazawa J.: "The Xq22 inversion breakpoint interrupted a novel Ras-like GTPase gene in a patient with Duchenne muscular dystrophy and profound mental retardation"Am J Hum Genet.. 71. 637-645 (2002)
• [文献書誌] Suminaga R, Takeshima Y, Adachi K, Yagi M, Nakamura H, Matsuo M.: "A novel cryptic exon in intron III of the dystrophin gene was incorporated into dystrophin mRNA with a single nucleotide deletion in exon 5"J Hum Genet.. 47. 196-201 (2002)
• [文献書誌] Matsuo M.: "Duchenne and Becker muscular dystrophy : from gene diagnosis to molecular therapy"IUBMB Life. 53. 147-152 (2002)
• [文献書誌] Adachi K, Takeshima Y, Wada H, Yagi M, Nakamura H, Matsuo M.: "Heterogous dystrophin mRNA produced by a novel splice acceptor site mutation in intermediate dystrophinopathy"Pediatr Res.. 53. 125-131 (2003)
• [文献書誌] Yagi M, Takeshima Y, Nakamura H, Matsuo M.: "Two alternative exons can result from activation of the cryptic splice acceptor site deep within intron 2 of the dystrophin gene in a patient with as yet asymptomatic dystrophinopathy"Hum Genet.. 112. 164-170 (2003)
• [文献書誌] Ito T.: "One of three examined purine-rich sequences selected from dystrophin exons exhibits splicing enhancer activity"Acta Myologica. 2. 151-153 (2001)
• [文献書誌] Matsuo M.: "Treatment of Duchenne muscular dystrophy at the mRDA level."Frontiers in human genetics diseases and technologies.. 347-361 (2001)
• [文献書誌] Tachi N.: "Fukuyama muscular dystrophy associated with lack of C-terminal domain of dystrophin."Pediatr. Neurol. 24. 373-378 (2001)
• [文献書誌] Takeshima Y.: "Nakamura, H, Matsuo, M. Oligonucleotides against a splicing enhancer sequence led to dystrophin production in muscle cells from a Duchenne muscular dystrophy patient."Brain Dev.. 23. 788-798 (2001)
• [文献書誌] Ito T.: "Purine-rich exon sequences are not necessarily splicing enhancer sequence in the dystrophin gene."Kobe. J. Med. Sci.. 47. 193-202 (2001)