| 研究課題/領域番号 |
13440194
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
無機化学
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
櫻井 武 金沢大学, 理学部, 教授 (90116038)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
14,200千円 (直接経費: 14,200千円)
2003年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2002年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2001年度: 10,900千円 (直接経費: 10,900千円)
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| キーワード | マルチ銅オキシダーゼ / ラッカーゼ / ビリルビンオキシダーゼ / 酸素還元 / 反応中間体 / 異種発現 / 変異体 / 三核銅クラスター / 銅タンパク質 / 三核銅センター / アミノ酸配列 / ビリルビンオキシターゼ / 活性酸素 / 反応機構 |
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| 研究概要 |
マルチ銅オキシダーゼは呼吸鎖の末端酸化酵素とともに酸素を4電子還元することのできる三核鋼部位を有している。基質から引き抜いた電子を酸素にトランスファーする過程において、活性酸素を系外に放出することなく水にまで変換することがこの酵素群の機能の特徴である。本研究ではまず、マルチ銅オキシダーゼのプロトタイプ酵素であるウルシラッカーゼのアミノ酸配列を初めて決定し、銅結合に関わるアミノ酸を特定した。次いで、ウルシラッカーゼの異種発現に挑戦し、大腸菌を宿主とし封入体を発現させた。また、酵母を宿主とする系の構築にも挑戦し、mRNAに転写させることに成功した。しかし、コドンの使用頻度の問題で、植物酵素を翻訳させることは困難であることが判明したので、大腸菌や酵母での発現に適した人工遺伝子を作成し、発現を試みているところである。一方、肝機能の検査に利用されているビリルビンオキシダーゼについても、酵母を宿主とする発現系に構築に挑戦し、大量発現系の構築に成功した。この組換え体は現在臨床検査に用いられている野生型酵素よりも活性が高く、また、安定性にも優れており、実用レベルに達していた。この異種発現酵素は野生型酵素とは幾分異なる磁気的性性質を示したが、1度ターンオーバーすると、野生型酵素と同じ休止状態に至ることがわかった。次いで、酸素結合部位および酸素の還元にかかわると思われるアミノ酸に変異導入した。タイプ3銅へのヒスチジン残基を配位性のアミノ酸に置換にしたところ、酵素活性は低下するが酵素活性は維持していることが判明した。また、酸素へプロトンを供給すると考えられるアスパラギン酸を変異させたところ、活性部位そのものが形成されないことから、このアミノ酸は構造形成にも寄与していることが判明した。さらに,タイプ1銅部位が空となった変異体を作成し、酸素還元中間体を長時間トラップすることに成功した。
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