| 研究課題/領域番号 |
13470061
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
細菌学(含真菌学)
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| 研究機関 | 宮崎医科大学 |
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研究代表者 |
林 哲也 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (10173014)
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| 研究分担者 |
中山 恵介 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (10347057)
大西 真 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10233214)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
12,500千円 (直接経費: 12,500千円)
2002年度: 3,700千円 (直接経費: 3,700千円)
2001年度: 8,800千円 (直接経費: 8,800千円)
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| キーワード | 病原性大腸菌O157 / ゲノム多型 / バクテリオファージ / PCR / 菌株識別法 |
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| 研究概要 |
病原性大腸菌O157菌株のゲノムの多様性の実態を明らかにすること、さらにその結果を基にO157の分子疫学のための新しい解析ツールを開発することを目的として、O157堺株のゲノム配列に基づいてO157の全ゲノムを約10Kb単位で増幅できるPCRプライマーセットを作製し、これを用いて各種O157株の全ゲノム構造を解析した(whole genome PCR scanning、以下WGPS)。まず、1998年に日本各地で分離されたO157臨床分離株からXbaIによる染色体切断パターンの大きく異なる8株を選択し、堺株を基準としてそれぞれの全ゲノム構造をWGPSで解析した。その結果、堺株と構造の異なる各菌株のゲノム領域が全て同定され、WGPSという新しいゲノム解析法を確立することができた。また、今回の解析結果から、O157菌株間には予想以上の多様性が存在し、特にラムダ様プロファージ領域には株間で大きな違いがあることが明らかになった。Stxファージについても同様であり、今回の解析から新しいタイプのStxファージが数種類同定された。各々の全ゲノム構造を現在解析中である。一方、通常のPCR法で解析ができる程度の大きさの多型性を示すゲノム領域も多数同定された。そこで、これらの領域をターゲットとしたmultiplex PCRによる新しい分子疫学解析法の開発を試みた。約30カ所の候補領域から9領域をターゲット領域として選択し、プライマー配列やPCR条件などの至適化を行い、最終的には、stx1遺伝子・stx2遺伝子・intimin遺伝子検出用のPCRを組み込んだ12種類のPCRによるシステムを構築した。このシステムを用いて、実際にO157臨床分離株の菌株識別を行ったところ、51株のO157を21タイプに分類できた。このシステムにもある程度有用性があると考えられるが、解像度がまだ不十分であること、また4本のチューブで反応する系であることなどの問題があるため、実用化に向けては、今後これらの点を改善する必要がある。なお、以上の解析と平行して、urease遺伝子の大腸菌株間における保有率およびtoxB遺伝子の機能解析を行い、それぞれの分布や機能の一部を明らかにした。
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