| 研究課題/領域番号 |
13470430
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
外科系歯学
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
上田 実 (2002-2003) 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (00151803)
水谷 英樹 (2001) 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (30167663)
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| 研究分担者 |
服部 宇 名古屋大学, 医学部附属病院, 助手 (60332699)
上田 実 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (00151803)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
9,600千円 (直接経費: 9,600千円)
2003年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2001年度: 7,600千円 (直接経費: 7,600千円)
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| キーワード | BMP(Bone Morphogenetic Protein) / SHH(Sonic Hedgehog) / 骨 / 軟骨 / プラスミドベクター / 筋弁 / 骨形成 / 骨軟骨形成 / アデノウィルスベクター |
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| 研究概要 |
ヒト、マウス由来臓器cDNAライブラリーよりヒト、マウスBMP-2、BMP-4、SHHcDNAを単離し,遺伝子配列を確認、cDNAを作製、ヒト、マウスのBMP-2、BMP-4、SHH活性部位をプラスミドベクターへ組み込み、ヒト、マウス口腔由来線維芽細胞に遺伝子導入を行い、遺伝子発現強陽性細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングの結果得られた強陽性細胞はマウス遺伝子導入マウス由来細胞のみであった。遺伝子発現強陽性細胞を大量培養し、ゼラチンカプセル内に細胞を封入し、ヌードマウス大腿部皮下へ移植したところ、軟X線写真で石灰化が確認でき、摘出組織のトルイジンブルー染色では軟骨のメタクロマジーとともに軟骨内骨化誘導が確認された。
マウス頸部、肩部、胸部、前後肢周囲において有茎筋弁の作製、維持に対する検討を行い、BMP-2、BMP-4、SHH遺伝子導入細胞移植、BMP-2、BMP-4、SHH遺伝子の直接導入による筋弁の骨化実験は、大胸筋、浅殿筋、大腿二頭筋において評価可能であることが示唆された。
マウスBMP-2、BMP-4、SHHcDNA挿入プラスミドベクターを各種cell line(A9,C3H10T1/2,KMS-6)、マウス口腔由来線維芽細胞に遺伝子導入したところ、C3H10T1/2、マウス口腔由来線維芽細胞では良好に遺伝子導入、上記遺伝子蛋白分泌が認められたが、A9、KMS-6ではほとんど認められなかった。また、マウスBMP-2、BMP-4、SHH遺伝子導入C3H10T1/2、マウス口腔由来線維芽紳胞の強陽性細胞の遺伝子発現は予想された様に一過性であり、継代数が1-12継代までは安定した蛋白分泌が認められたが、それ以降は急激に減少した。
大胸筋、浅殿筋、大腿二頭筋の筋弁にBMP-2、BMP-4、SHH遺伝子導入強陽性細胞移植、同様の筋弁に直接遺伝子導入実験を行った。筋弁にマウスBMP-2、BMP-4、SHHcDNA挿入プラスミドベクター遺伝子導入強陽性細胞をゼラチンカプセル内に封入し、筋弁中央部に移植したところ、移植10日後にはいずれの筋弁の移植部位おいても軟X線写真で石灰化が確認でき、摘出組織のトルイジンブルー染色では軟骨のメタクロマジーとともに軟骨内骨化誘導が確認された。しかしながら骨軟骨形成部位は担体ゼラチンカプセルを移植した範囲に限定されていた。
また、マウスBMP-2、BMP-4、SHHcDNA挿入プラスミドベクターをマイクロバブルと混合、1mlシリンジにて筋弁内に注入し、直上より超音波刺激による遺伝子導入を施行した。遺伝子導入14日後にはいずれの遺伝子導入部位においてもわずかながら軟X線写真で石灰化が確認でき、骨軟骨組織形成がトルイジンブルー染色で確認された。骨軟骨形成は細胞移植による形成範囲に及ばず、極めて狭い範囲であった。
本研究においてBMP遺伝子、SHH遺伝子を組み込んだベクター導入細胞移植、直接遺伝子導入のいずれにおいても移植筋の骨軟骨への転化という現象が確認された。
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