| 研究課題/領域番号 |
13470510
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用薬理学・医療系薬学
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
山添 康 東北大学, 大学院・薬学研究科, 教授 (00112699)
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| 研究分担者 |
古川 正幸 大塚製薬株式会社, 研究員
宮田 昌明 東北大学, 大学院・薬学研究科, 助手 (90239418)
永田 清 東北大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (80189133)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
14,300千円 (直接経費: 14,300千円)
2002年度: 5,300千円 (直接経費: 5,300千円)
2001年度: 9,000千円 (直接経費: 9,000千円)
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| キーワード | 酵素誘導 / 安定発現 / CYP3A4 / ヒト薬物代謝 / インダクション / 誘導評価系 / 安定発現株 / レポーターアッセイ / スクリーニング / in vivo / CYP3A / cyt.P450 / Induction / PXR |
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| 研究概要 |
CYP3A4の誘導を予測する系として、アデノウイルスベクターを用いたヒトCYP3A4の誘導評価系の構築に成功した。しかしアデノウイルスベクターを用いた遺伝子発現は一過性であり、評価を行うたびにウイルス感染を行わなければならないなどの問題点がある。そこでCYP3A4遺伝子コンストラクトを安定に発現する細胞誘導評価系を検討した。より本来の生体内反応に近い評価を行うため外来性プロモーターを用いることなくCYP3A4遺伝子固有のプロモーターおよびエンハンサーを使用して評価することを考慮しながらも高い誘導率を示すCYP3A4遺伝子コンストラクト安定発現株を構築した。
安定発現株を作成するにあたり、ヒトCYP3A4遺伝子の約-300bp付近に存在するPXR結合配列(ER-6)と-7k付近のPXR結合配列(dNR)を複数含むエンハンサー領域を含むホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を付加したコンストラクト(CYP3A4-362-7.7k)のアデノウイルスを作成した。これらのアデノウイルスを用い、安定発現株作成に用いるCYP3A4遺伝子コンストラクトとして適した構造について検討した。同様な方法でhPXRのアデノウイルス(AdhPXR)も作成した。今回、用いる細胞株としてはヒト肝臓癌由来細胞であるHepG2細胞を選んだ。実験の結果でHepG2由来で安定にCYP3A4遺伝子を発現する数種の株化細胞を得ることに成功した。これらはリファンピシンよりもクロトリマゾール処置の方がより高い誘導率を示した。反対にリファンピシンでより強い誘導率を示すような細胞株も得られた。これらは典型的なCYP3A4誘導剤に応答して高いルシフェラーゼ活性を示し、評価系として適用可能なことが明らかになった。
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