| 研究課題/領域番号 |
13480297
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医用生体工学・生体材料学
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
田村 実 愛媛大学, 工学部, 助教授 (00128349)
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| 研究分担者 |
中村 洋一 大阪府立大学, 農学部, 教授 (90180413)
吉田 敏 岐阜大学, 工学部, 教授 (50158440)
三浦 恵 横浜市立大学, 医学部, 助教授 (60157427)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
12,400千円 (直接経費: 12,400千円)
2002年度: 5,900千円 (直接経費: 5,900千円)
2001年度: 6,500千円 (直接経費: 6,500千円)
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| キーワード | スーパーオキシド / 活性酸素 / NADPH oxidase / シトクロム b_<558> / Nox / Duox family / 好中球 / 融合タンパク質 / 低分子量Gタンパク / Superoxide / Reactive oxygen / Cytochrome b_<558> / duox family / Neutrophilts / Fusion protein / Small GTPase / Reactive oxygen species / Phox / Nox family / Neutrophils / Small G-protein |
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| 研究概要 |
[1]安定でクリーンなO_2^-発生源の完成(田村)
[67N-47N融合タンパク] NADPH oxidaseの制御サブユニットp47の自己制御をはずすために、短縮型p47(47N)を短縮型p67(67N)とつないだ融合型を遺伝子工学的に創製した。
[RacQ61L 変異体] Racの代わりに恒常的活性型のRac変異体Q61Lを使うことにより、67NとRacの間を格段に安定化できることを見い出した。また、これと上述の67N-47Nとを組み合わせて酵素を再構成すると、これまでのどの場合より安定なcomplexが得られた。
[活性化剤SDSの割愛]我々はcytochrome b_<558>を再脂質化する際の脂質の組成を工夫することにより、活性化剤SDSなしで、酵素が活性化できることを見い出した。
[保存法]濃い濃度で酵素サブユニットを混ぜて活性化させたのち、凍結すると、解凍後も活性が全く落ちていないことを見い出した。これにより、活性化酵素を凍結した状態で発送し、利用者は実験時に解凍して用いることが可能になった。
[2]完成した新規デバイスの応用
アミロイド形成の実験系としてしばしば用いられるHEK細胞を用いてO_2^-の影響を調べた。デバイスを5,000倍希釈で用いた時、細胞の増殖がとまり、500倍希釈では細胞死が起こることが親察された(三浦)。SODを共存させた時にはこのような現象は見られなかった。一方、ニューロン細胞ではさらに高濃度のデバイスを加えた時,細胞死が起こった(中村)。また、海馬スライスへのO_2^-の影響を継続的に調べるための予備実験として、実験用シャーレにメジウムとデバイスを入れ特殊電極により測定したところ、デバイスから多量の活性酸素が発生していることが確認された(吉田)。
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