| 研究課題/領域番号 |
13555226
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
加藤 滋雄 神戸大学, 自然科学研究科, 教授 (20026272)
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| 研究分担者 |
田中 久雄 協和発酵工業株式会社, 工務部, 技術開発室長
塩見 尚史 神戸女学院大学, 人間科学部, 助教授 (20299077)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
13,900千円 (直接経費: 13,900千円)
2002年度: 4,200千円 (直接経費: 4,200千円)
2001年度: 9,700千円 (直接経費: 9,700千円)
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| キーワード | 分泌生産 / α-アミラーゼ / プロテオーム解析 / リポソーム / メンブレンブロット / メタノール代謝系酵素 / 抗ペプチド抗体 / C-末端健全体 / プロテアーゼ |
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| 研究概要 |
組換え微生物によるタンパク質分泌生産は、活性タンパク質が得られ、分離も容易なためバイオ生産に広く用いられている。しかし、シグナル切断の不完全さやプロテアーゼの影響で必ずしも望みのタンパク質が高い収率で得られない。そこで、迅速測定法を用いる産生タンパク質の特性解析、細胞の生育状況の指標タンパク質ならびにプロテアーゼの測定に基づくプロテオーム解析により、分泌生産特性を的確に把握して培養制御を行い、分泌生産の効率化を図る手法を構築することした。
モデル分泌タンパク質として、α-アミラーゼ遺伝子を宿主酵母S.cerevisiaeおよびPichia pastorisに形質転換した。これらを用いてα-アミラーゼを分泌生産させ、その分泌効率に与える培養条件の検討、マーカー酵素の発現特性、ならびにC-末端部の特定領域を認識する抗ペプチド抗体を用いて、培養状態の把握と分泌タンパク質の迅速なキャラクタリゼーションを行うことを目指した。本研究で得られた主要な成果は、*α-アミラーゼのC-末端部に対する抗ペプチド抗体を用いて、C-末端部の健全なα-アミラーゼを検出できた。
*Pichia pastorisを宿主とし、AOX1プロモーターをメタノールで誘導し、適切なメタノールの供給をDOスタットで行うことによって、高いα-アミラーゼの比分泌生産速度を達成することができた。
*抗体結合リポソームを用いるメンブレンブロット法が開発でき、迅速、高感度に発現タンパク質の測定が可能となった。
*メタノール資化代謝系酵素の活性は、メタノールによる誘導によって著しく高まり、α-アミラーゼの比分泌生産速度と関連づけられた。
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