| 研究課題/領域番号 |
13556011
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
小林 達彦 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70221976)
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| 研究分担者 |
合田 昌彦 日本学術振興会, 応用生物化学系, 特別研究員(PD)
東端 啓貴 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (20344864)
橋本 義輝 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (00323254)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
13,900千円 (直接経費: 13,900千円)
2003年度: 3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
2001年度: 6,200千円 (直接経費: 6,200千円)
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| キーワード | プロモーター / 遺伝子 / 発現 / ロドコッカス |
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| 研究概要 |
Rhodococcus rhodocurous J1菌由来のタンパク質誘導発現系(ニトリラーゼ系とニトリルヒドラターゼ系)が既に取得されているが、ニトリラーゼ系を利用した場合、εカプロラクタムあるいはシアノバレルアミドを誘導剤とした場合に35%以上を占めるほどニトリラーゼ(ニトリルを酸とアンモニアに分解する酵素)が、ニトリルヒドラターゼ系を利用した場合、尿素を誘導剤とした場合に50%以上を占めるほどニトリルヒドラターゼ(ニトリルをアミドに分解する酵素)が著量発現する。
ニトリラーゼ遺伝子プロモーター,ニトリラーゼ構造遺伝子,転写活性化タンパク質遺伝子から構成される本ニトリラーゼ系に対して、切り縮め実験を行った。すなわち、上流域や下流域などを様々に欠失させた断片をそれぞれ構築した。続いて、構築した数種の切り縮め断片を大腸菌で複製するベクターに連結し、得られたプラスミドをそれぞれ大腸菌に導入し、大腸菌内での発現を検討した。しかし、高速液体クロマトグラフィーによるアッセイおよびSDS-PAGEの結果、ニトリラーゼ活性が検出できなかったことから、Rhodococcus菌由来のタンパク質誘導発現系は大腸菌内では機能しないことが判明した。
J1菌とは別のRhodococcus属放線菌において発現するかを確認した結果、ニトリラーゼおよびニトリルヒドラターゼいずれの酵素も高発現が確認できたことから高発現ベクターを構築できる可能性が示唆された。そこで、産業上有用な特徴を有するロドコッカス属放線菌の宿主としての利用を目指し、遺伝子組換え系(宿主・ベクター系)の開発を試みた。当研究室保有のロドコッカス属放線菌、国内外の微生物保存機関から購入した計100株以上のロドコッカス属放線菌を対象として、プラスミドを検索したところ、数種のプラスミド保有株がスクリーニングできた。一部のプラスミドについて大腸菌とのシャトルベクターを構築することに成功した。
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