イヌヘルペスウイルスをベクターとする犬原虫感染症の多価生ワクチンの開発

• 研究課題/領域番号: 13556049
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 展開研究
• 研究分野: 応用獣医学
• 研究機関: 帯広畜産大学
• 研究代表者: 玄 学南 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 助教授 (10292096)
• 研究分担者: 横山 直明 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 助教授 (80301802) ; 井上 昇 帯広畜産大学, 原虫病研究センター, 助教授 (10271751) ; 土屋 耕太郎 (財)日本生物科学研究所, 主任研究員 (70207405) ; 岩田 晃 (財)日本生物科学研究所, 主任研究員 (70193745) ; 河本 麻里子 動物衛生研究所, 主任研究官 (00355158)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 13,600千円 (直接経費: 13,600千円); 2004年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円); 2003年度: 2,700千円 (直接経費: 2,700千円); 2002年度: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2001年度: 4,800千円 (直接経費: 4,800千円)
• キーワード: バベシアギブソニ / ネオスポラ / イヌヘルペスウイルス / ベクターワクチン / ワクシニアウイルス / 組換えワクチン / 犬 / 原虫感染症 / 大腸菌発現性 / バキュロウイルス / SCIDマウス感染モデル / 大腸菌発現系 / cDNAライブラリー

研究概要

本研究はイヌヘルペスウイルスをベクターとする犬原虫感染症の多価生ワクチンを開発することを目的として実施した。4ヶ年に渡り得られた主な研究成績は以下の通りである。
1)イヌヘルペスウイルスのベクター化
イヌヘルペスウイルスについて幅広い遺伝子検索を行い、TK、gE、gI、ORF2など外来遺伝子挿入可能な候補遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、ウイルス増殖には必ずしも必要としないため簡単に欠損させることができることを確認した。これらの遺伝子の部位にカラーと薬剤セレクションマーカーを組み合わせたLacZ-TK遺伝子を導入することにより、迅速で簡便に組換えイヌヘルペスウイルスを構築する方法を確立した。
2)犬の病原性原虫のワクチン候補遺伝子のクローニング
バベシアギブソニとネオスボラなどイヌ病原性原虫のcDNAライブラリーを作製し、イムノスクリーニング法によりそれぞれの主要抗原遺伝子を同定・クローニングし、その性状解析を行った。新しく同定或いは性状解析した抗原遺伝子としてバベシアギブソニ(Babesia gibsoni)のBgP29、BgP50、BgP76、BgTRAP、BgAMA-1、BgRAP-1、Bg12D3;ネオスポラ(Neospora caninum)のNcSAG1、NcSRS2、NcGRA7、NcPDI、NcRP1、NcHSP70などを挙げられる。
3)原虫抗原を発現する組換えウイルスの構築
B.gibsoniのBgP29、BgP50、BgP76及びN.caninumのNcSAG1、NcSRS2を発現する組換えイヌヘルペスウイルス或いは組換えワクシニアウイルスの構築に成功した。組換えウイルスにより発現された多くの組換え原虫抗原は虫体由来の天然型抗原に類似した抗原性を有していることが確認された。
4)試作組換えワクチンの感染防御効果
NcSRS2を発現する組換えウイルスを鼻内接種した犬では、虫体由来の天然型NcSRS2抗原に特異的な液性免疫が有効に誘導されることが確認された。また、BgP29、BgP50、及びBgP76を発現する組換えウイルスを接種した犬では、いずれもバベシアギブソニ感染に対する部分的感染防御効果が認められた。

研究成果

• [雑誌論文] Detection of antibodies to Neospora caninum in cattle by enzyme-linked immunosorbent assay with truncated NcSRS2 expressed in Escherichia coli. (2005)
  • 著者名/発表者名: Gaturaga et al.
  • 雑誌名: Journal of Parasitology 91 ページ: 191-192
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification and characterization of cross-reactive antigens from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. (2005)
  • 著者名/発表者名: Liao et al.
  • 雑誌名: Parasitology 129 ページ: 481-486
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Immunization with recombinant surface antigen P50 of Babesia gibsoni expressed ininsect cells induced parasite growth inhibition in dogs. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto et al.
  • 雑誌名: Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12 ページ: 557-559
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification and characterization of cross-reactive antigens from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. (2005)
  • 著者名/発表者名: Liao, M., Xuan, X., Shirafuji, H., Fukumoto, S., Hirata, H., Suzuki, H., Fujisaki, K.
  • 雑誌名: Parasitol. 130 ページ: 481-488
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Immunization with recombinant surface antigen P50 of Babesia gibsoni expressed in insect cells induced parasite growth inhibition in dogs. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Suzuki, H., Xuan, X.
  • 雑誌名: Clin.Diagn.Lab.Immunol. 12 ページ: 557-559
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification and characterization of cross-reactive antigens from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. (2005)
  • 著者名/発表者名: Liao et al.
  • 雑誌名: Parasitology 129(印刷中)
• [雑誌論文] Immunization with recombinant surface antigen P50 of Babesia gibsoni expressed in insect cells induced parasite growth inhibition in dogs. (2005)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto et al.
  • 雑誌名: Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12(印刷中)
• [雑誌論文] Inhibitory effect of antiserum to surface antigen P50 of Babesia gibsoni on growth of parasites in canine red blood cell-substituted severe combined immunodeficiency mice. (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto et al.
  • 雑誌名: Infection and Immunity 72 ページ: 1795-1798
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Serodiagnosis of canine Babesia gibsoni infection by enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant P50 expressed in Escherichia coli. (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto et al.
  • 雑誌名: Journal of Parasitology 90 ページ: 387-391
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Serodiagnosis of Babesia gibsoni infection in dogs by an improved enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant truncated P50 (2004)
  • 著者名/発表者名: Verdida et al.
  • 雑誌名: Journal of Veterinary Medical Science 66 ページ: 1517-1521
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Inhibitory effect of antiserum to surface antigen P50 of Babesia gibsoni on growth of parasites in canine red blood cell-substituted severe combined immunodefciency mice. (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Xuan, X., Igarashi, I., Sugimoto, C., Fujisaki, K., Nagasawa, H., Mikami, T., Suzuki, H.
  • 雑誌名: Infect.Immun. 72 ページ: 1795-1798
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Serodiagnosis of canine Babesia gibsoni infection by enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant P50 expressed in Escherichia coli. (2004)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Sekine, Y., Xuan, X., Igarashi, I., Sugimoto, C., Nagasawa, H., Fujisaki, K., Mikami, T., Suzuki, H.
  • 雑誌名: J.Parasitol. 90 ページ: 387-391
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Serodiagnosis of Babesia gibsoni infection in dogs by an improved enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant truncated P50. (2004)
  • 著者名/発表者名: Verdida, R.A., Hara, O.A., Xuan, X., Fukumoto, S., Igarashi, I., Zhang, S., Dong, J., Inokuma, H., Kabeya, H., Sato, Y., Moritomom T., Maruyama, S., Claveria F, Nagasawa, H.
  • 雑誌名: J.Vet.Med.Sci. 66 ページ: 1517-1521
  • NAID: 110003963643
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Molecular characterization of a gene encoding 29 kDa cytoplasmic protein of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potentiality. (2003)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Xuan, X., Inoue, N., Igarashi, I., Sugimoto, C., Fujisaki, K., Nagasawa, H., Mikami, T., Suzuki, H.
  • 雑誌名: Mol.Biochem.Parasitol. 131 ページ: 129-136
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] High-level expression of truncated major surface antigen P50 of Babesia gibsoni in insect cells by baculovirus and evaluation of its immunogenicity. (2003)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Xuan, X., Kadota, K., Igarashi, I., Sugimoto, C., Fujisaki, K., Nagasawa, H., Mikami, T., Suzuki, H.
  • 雑誌名: Clin.Diagn.Lab.Immunol. 10 ページ: 596-601
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Serodiagnosis of Neospora caninum infection in cattle by enzyme-linked immunosorbent assay with recombinant truncated NcSAG1. (2003)
  • 著者名/発表者名: Chahan, B., Gaturaga, I., Huang, X., Min, L., Fukumoto, S., Hirata, H., Nishikawa, Y., Suzuki, H., Sugimoto, C., Igarashi, I., Mikami, T., Xuan, X.
  • 雑誌名: Vet.Parasitol. 118 ページ: 177-185
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Canine herpesvirus ORF2 is a membrane protein modified by N-linked glycosylation. (2002)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa, Y., Kimura, M., Xuan, X., Makala, L., Nagasawa, H., Mikami, T., Otsuka, H.
  • 雑誌名: Virus Res. 87 ページ: 1-9
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification and expression of a 50-kilodalton surface antigen of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potential in an enzyme-linked immunosorbent assay. (2001)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Xuan, X., Nishikawa, Y, Inoue, N., Igarashi, I., Nagasawa, H., Fujisaki, K., Mikami, T.
  • 雑誌名: J.Clin.Microbiol. 39 ページ: 2603-2609
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Development of a polymerase chain reaction method for diagnosing Babesia gibsoni infection in dogs. (2001)
  • 著者名/発表者名: Fukumoto, S., Xuan, X., Shigeno, S., Kimbita, E., Igarashi, I., Nagasawa, H., Fujisaki, K., Mikami, T.
  • 雑誌名: J.Vet.Med.Sci. 63 ページ: 977-981
  • NAID: 110003920731
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Characterization of Neospora caninum surface protein NcSRS2 based on baculovirus expression system and its application for serodiagnosis of Neospora infection. (2001)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa, Y., Kousaka, Y., Tragoolpua, K., Xuan, X., Makala, L., Fujisaki, K., Mikami, T., Nagasawa, H.
  • 雑誌名: J.Clin.Microbiol. 39 ページ: 3987-3991
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Protective efficacy of vaccination by recombinant vaccinia virus against Neospora caninum infection. (2001)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa, Y., Inoue, N., Xuan, X., Nagasawa, H., Igarashi, I., Fujisaki, K., Otsuka, H., Mikami, T.
  • 雑誌名: Vaccine 19 ページ: 1381-1390
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Prevention of vertical transmission of Neospora caninum in BALB/c mice by recombinant vaccinia virus carrying NcSRS2 gene. (2001)
  • 著者名/発表者名: Nishikawa, Y., Xuan, X., Nagasawa, H., Igarashi, I., Fujisaki, K., Otsuka, H., Mikami, T.
  • 雑誌名: Vaccine 19 ページ: 1710-1716
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fukumoto, S., et al.: "Molecular characterization of a gene encoding a 29-kDa cytoplasmic protein of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potentiality"Mol.Bio.Parasitol.. 131・2. 129-136 (2003)
• [文献書誌] Fukumoto, S., et al.: "High-level expression of truncated surface antigen P50 of Babesia gibsoni in insect cells by baculovirus and evaluation of its immunogenicity and antigenicity"Clin.Diagn.Lab.Immunol.. 10・4. 596-601 (2003)
• [文献書誌] Tanaka, T., et al.: "Antiviral activity of lactoferrin against canine herpesvirus"Antiviral Res.. 60・3. 193-199 (2003)
• [文献書誌] Chahan, B., et al.: "Serodiagnosis of Neospora caninum infection in cattle by ELISA with recombinant truncated NcSAG1"Vet.Parasitol.. 118・3-4. 177-185 (2003)
• [文献書誌] Nishikawa, Y., et al.: "Canine herpesvirus ORF2 is a membrane protein modified by N-linked glycosylation"Virus Res.. 87・1. 1-9 (2002)
• [文献書誌] Nishikawa, Y., et al.: "Neospora caninum NcSRS2 is a transmembrane protein that contains a glycosylphosphatidylinositol anchor in insect cells"Vet.Parasitol.. 109・3. 191-201 (2002)
• [文献書誌] Nishikawa, Y., et al.: "Characterization of Neospora caninum surface protein NcSRS2 based on baculovirus expression system and its application for serodiagnosis of Neospora infection"J.Clin.Microbiol.. 39・11. 3987-3991 (2002)
• [文献書誌] Fukumoto, S., et al.: "Cloning and expression an antigen of Babesia gibsoni in Escherichia coli and its use for the immunodiagnosis of canine babesiosis"J.Protozool.Res.. 12(印刷中). (2002)
• [文献書誌] Fukumoto, S., et al.: "Identification and expression of a 50-kilodalton surface antigen of Babesia gibsoni and evaluation of its diagnostic potential in an enzyme-linked immunosorbent assay"J. Clin. Microbiol. 39・7. 2603-2609 (2001)
• [文献書誌] Fukumoto, S., et al.: "Development of a polymerase chain reaction method for diagnosing Babesia gibsoni infection in dogs"J. Vet. Med. Sci. 63・9. 977-981 (2001)
• [文献書誌] Nishikawa, Y., et al.: "Expression of canine interferon-gamma by a recombinant vaccinla virus and its antiviral effect"Virus Res.. 75・2. 113-121 (2001)
• [文献書誌] Nishikawa, Y., et al.: "Prevention of vertical transmission of Neospora caninum in BALB/c mice by recombinant vaccinia virus carrying NcSRS2 gene"Vaccine. 19・13. 1710-1716 (2001)
• [文献書誌] Nishikawa, Y., et al.: "Protective efficacy of vaccination by recombinant vaccinia virus against Neospora caninum infection"Veccine. 19・11. 1381-1390 (2001)
• [文献書誌] Fukumoto, S., et al.: "Morphological changes of Babesia gibsoni grown in canine red blood cellsubstituted severe combined immune deficiency mice"J. Parasitol.. 86・5. 956-958 (2000)