| 研究課題/領域番号 |
13557004
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
生理学一般
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
栗原 敏 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (90057026)
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| 研究分担者 |
草刈 洋一郎 東京慈恵医科大学, 医学部, 助手 (80338889)
渡辺 美智子 東京慈恵医科大学, 医学部, 助手 (10158660)
須田 憲男 東京慈恵医科大学, 医学部, 講師 (80201581)
井上 敏 チッソ(株), 横浜研究所, 次席研究員
田中 悦子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70256410)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
6,300千円 (直接経費: 6,300千円)
2003年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2002年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2001年度: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
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| キーワード | 組み換えイクオリン / 天然型イクオリン / Ca^<2+> / Mg^<2+> / 温度依存性 / 変異組み換えイクオリン / 発光 / pH / 変異型組み換えイクオリン / Caイオン / Mgイオン / 変異型組換えイクオリン / イクオリン / 遺伝子組換え / 変異イクオリン / Ca応答性 |
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| 研究概要 |
天然型イクオリンは発光クラゲから抽出・精製されてきたが、発光クラゲが減り採取が不可能になった。井上はイクオリン遺伝子をクローニングし、大腸菌でアポイクオリンを発現させ、高純度組換えイクオリンを大量に精製する方法を確立した。本研究では、アポイクオリン分泌発現ベクターpiP-HEを用いて大腸菌に発現させ、分泌アポイクオリンを還元状態で発光基質セレンテラジンと撹拌してイクオリンを再生、精製した。組換えイクオリンの発光特性を天然型イクオリンと比較した。細胞内イオン環境類似塩溶液を作製し(150mM KCl,10mM PIPES、pH 7.0)、種々のCa^<2+>濃度溶液と、5μlのイクオリンを瞬時に混和し発光を記録した。各Ca^<2+>濃度の光信号をpCa2の光信号のピーク値で除しその対数値をpCaに対してプロットしてCa^<2+>濃度・光信号関係を得た。組換えイクオリンのCa^<2+>濃度・光信号関係は天然型と比べ、pCa5-pCa6間で感度がよく、Ca^<2+>-independent lightは低かった。組換えイクオリンの発光は、Mg^<2+>濃度を0から1mMに増加させると抑制された。最大発光は影響されず、pCa5以上で抑制が強かった。pHを変化させても(pH7.5-6.5)組換えイクオリンの発光はほとんどされなかった。組換えイクオリンをマウス左心室乳頭筋細胞内に注入し、Ca^<2+> transient(CaT)を測定した。CaTのピーク値は約3μMで天然型イクオリンでの値よりも大きかった。CaTがピークに達するまでの時間には差がなかったが、末尾のところがやや速かった。組換えイクオリンが細胞内に応用可能で、汎用できる道が開けた。
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