う蝕原性口腔連鎖球菌グルカン合成酵素の立体構造解析に基づく新規阻害剤創製

• 研究課題/領域番号: 13557161
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 展開研究
• 研究分野: 保存治療系歯学
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 福井 一博 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (70034171)
• 研究分担者: 井上 哲圭 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (20223258) ; 前田 博史 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (00274001) ; 苔口 進 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (10144776) ; 西村 英紀 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (80208222) ; 児玉 孝雄 九州工業大学, 情報工学部, 教授 (30034200) ; 小西 法文 岡山大学, 歯学部附属病院, 講師 (60243466) ; 村山 洋二 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (50029972)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2004
• 研究課題ステータス: 完了 (2004年度)
• 配分額: 11,800千円 (直接経費: 11,800千円); 2004年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 2003年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円); 2002年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円); 2001年度: 5,100千円 (直接経費: 5,100千円)
• キーワード: 水不溶性グルカン合成酵素 / 口腔連鎖球菌 / デキストラン / 二次構造 / GTF-I / Streptococcus / 触媒ドメイン / 結晶化 / グルカン合成酵素 / 口腔レンサ球菌 / 立体構造解析 / GTF / X線結晶解析 / 大量発現系 / 立体構造 / 不溶性グルカン合成酵素

研究概要

口腔連鎖球菌Streptococcus sobrinusの不溶性グルカン合成酵素(GTF-I)は,ショ糖を分解し,水不溶性のグルカンを合成する酵素である。本菌のう蝕誘発性の原因とされるこの酵素の構造機能解析を行うために,本研究ではその立体構造解析に向けて,グルカン合成酵素の大量発現系の構築,精製法の確立,および結晶化条件の検討を行った。本酵素は,N末側の触媒ドメイン(GS)とC末側のデキストラン結合ドメイン(DXB)から構成されている。結晶化を試みるに先立ち,まず完全長GTF-I, N末端部分欠損体(83残基の欠損)GS-6R,および触媒ドメインのみからなるGSのそれぞれのタンパク質の大腸菌での発現系を構築した。菌体破砕液から,硫安分画,イオン交換クロマトグラフィー,吸着クロマトグラフィー,ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせることにより,それぞれのタンパク質を高収率で精製する方法を確立した。結晶化条件のスクリーニングは,ハンギングドロツプ法で行った。まず,pH,塩濃度,および沈澱剤の有無などの条件を検討した結果,完全長GTFではpH6-8,塩濃度0-0.2Mの範囲で微結晶を多く得られた。GS-6Rでは,いかなる条件でも微結晶はほとんど得られなかった。GSでは最も多くの微結晶が得られ,その条件は完全長GTFの場合と類似した。いずれの場合も沈澱剤の効果は見られなかった。さらに,DXBドメインのflexibilityを抑制する条件として,低温下あるいはデキストラン結合下でのスクリーニングを行ったが,結晶生成への改善効果は認められなかった。現在得られている微結晶は,X線結晶解析に供するには十分ではないが,本研究の結果をもとに,結晶化条件の最適化を目指す。