• 研究課題をさがす
  • 研究者をさがす
  • KAKENの使い方
  1. 前のページに戻る

GFPを用いた蛋白性蛍光電位センサーの開発

研究課題

研究課題/領域番号 13558097
研究種目

基盤研究(B)

配分区分補助金
応募区分展開研究
研究分野 神経・筋肉生理学
研究機関岡崎国立共同研究機構

研究代表者

中井 淳一  岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助手 (80237198)

研究期間 (年度) 2001 – 2002
研究課題ステータス 完了 (2002年度)
配分額 *注記
11,700千円 (直接経費: 11,700千円)
2002年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2001年度: 9,400千円 (直接経費: 9,400千円)
キーワードGFP / 蛍光 / 膜電位 / バイオセンサー / 電位依存性カリウムチャネル / 分子生物学
研究概要

この研究の目的は、Green Fluorescent Protein(GFP)を用いて膜電位の変化を蛍光変化に変換する蛋白性蛍光電位センサープローブを開発し、in vivoで細胞膜の電位変化を可視化する技術を開発することにある。
平成13年度
クローン化した電位依存性カリウムチャネルの電位センサー部分(S4領域)近傍にGFPを挿入し、膜電位の変化でS4領域が膜内を移動したときGFPに蛍光変化が起こるようセンサーをデザインすることを試みた。作成した遺伝子はHEK293細胞に発現させ蛍光顕微鏡にて機能を検討した。まずGFPをS4の直後に挿入したいくつかのクローンを作成した、この場合いずれもGFPの蛍光がほとんど観察されなかった。これ原因として蛋白質の立体障害によることが考えられる。そこでGFPをS1の直前、S3の直前、S4の直前に組み込んだセンサー分子を新たに試作した。これらを細胞に発現させたところやや蛍光は弱いものの蛍光を発する蛋白質を生成することが明らかになった。これらの実験事実よりS1,S3,S4の部位を用いてFRETを利用したセンサーを作成できると予想された。
平成14年度
S4直後は最も興味のある部位であるのでS4領域について、平成13年度の結果を踏まえてさらに研究を行った。つまりS4以降を欠損させたカリウムチャネルのS4直後にGFPを結合した一連のクローンを作成した。これらのクローンを培養細胞に発現させたとき、いずれも蛍光を発する蛋白質を生成した。ただ電位依存性カリウムチャネルの一部を欠損させると生成された蛋白質は細胞内(主に小胞体、ゴルジ体、核膜)に留まり、細胞表面の形質膜に発現しているものは極一部であった。次にこの問題を解決するため形質膜に発現することが知られているアミノ酸転移酵素と開発中の電位プローブのfusion蛋白質を作成し検討した。その結果、プローブ蛋白質の形質膜への移行が促進され、この方法が有効であることがわかった。今後プローブの電位変化による蛍光変化量を増加するよう研究を進めていく。

報告書

(3件)
  • 2002 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2001 実績報告書
  • 研究成果

    (16件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (16件)

  • [文献書誌] Nakai, J., Ohkura, M.: "Probing calcium ions with biosensors"Biotechnol. and Genetic Engineering Reviews. (in press). (2003)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Protasi, F. et al.: "Multiple regions of RyR1 mediate functional and structural interactions with α 1s-DHPR in skeletal muscle"Biophys.J.. 83. 3230-3244 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Proenza, C. et al.: "Identification of a region of RYR1 that participates in allosteric coupling with the α 1s (CaV1.1)II-III loop"J.Biol.Chem.. 277. 6530-6535 (2003)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 中井淳一, 大蔵正道: "GFPを用いた蛍光カルシウムプローブG-CaMPの開発"比較生理生化学. 19. 135-145 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ikeda, K. et al.: "Degeneration of the amygdala and enhanced fear/anxiety behaviours in sodium pump alpha2 subunit gene deficient mice"J.Neurosci.. (in press).

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Imamura, M. et al.: "Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori"Genetics. (in press).

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Proenza, C. et. al.: "Identification of a region of RYR1 that participates in allosteric coupling with the α_<1S> (CaV1.1) II-III loop"J. Biol. Chem.. 277. 6530-6535 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Protasi, F. et. al.: "Multiple regions of RyRI mediate functional and structural interactions with a1_<1s>-DHPR in skeletal muscle"Biophys. J.. 83. 3230-3244 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakai, J. and Ohkura, M.: "Probing calcium ions with biosensors."Biotechnol. and Genetic Engineering Review. in press.

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Ikeda, K. et. al.: "Degeneration of the amygdala and enhanced fear/anxiety behaviours in sodium pump alpha2 subunit gene deficient mice"J. Neurosci.. in press.

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Imamura, M. et.al.: "Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori"Genetics. in press.

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Nakai, J. and Ohkura, M.: "Development of GFP-based Fluorescent Ca^<2+> probe G-CaMP"Comp. Physiol. and Biochem.. 19. 135-145 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Proenza, C.: "Identification of a region of RYR1 that Participates in allosteric coupling with the α_<1S>(CaV1.1)II-III looP"J. Biol. Chem.. 277. 6530-6535 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Protasi, F.: "Multiple regions of RyR1 mediate functional and structural interactions with α_<1S>-DHPR in skeletal muscle"Biophys. J.. 83. 3230-3244 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] 中井淳一: "GFPを用いた蛍光カルシウムプローブG-CaMPの開発"比較生理生化学. 19. 135-145 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Proenza C, O'Brien J, Nakai J, Mukherjee S, Allen PD, Beam KG.: "Identification of a region of RyR1 that participates in allosteric coupling with the alpha(1S) (Ca(V)1.1) II-III loop"J. Biol. Chem.. 277. 6530-6535 (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書

URL: 

公開日: 2001-04-01   更新日: 2016-04-21  

サービス概要 検索マニュアル よくある質問 お知らせ 利用規程 科研費による研究の帰属

Powered by NII kakenhi