| 研究課題/領域番号 |
13650849
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
成田 光章 東京農工大学, 工学部, 教授 (40015102)
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| 研究分担者 |
吉田 裕美 株式会社海洋バイオテクノロジー研究所, 釜石研究所, PD研究員 (10313305)
NARITA Mitsuaki Faculty of Technology, Department of Biotechnology, Professor (40015102)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
2,800千円 (直接経費: 2,800千円)
2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2001年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | DnaA / oriC / PCR / 蛍光共鳴エネルギー転移 / サルモネラ / 部位特異的変異 / 蛍光修飾蛋白質 / PCR産物 / サルモネラ属 / 蛋白質工学 |
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| 研究概要 |
サルモネラ属検出試験は疫学的、医学的に重要であり、PCR等の遺伝子工学的手法を利用することによりその迅速化が計られてきた。本研究では、2本鎖DNAの特異的塩基配列を認識する蛋白質DnaAを用いて直接PCR産物を認識させ、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を原理として用いてホモジニアスな系での迅速な測定方法の開発をめざした。
遺伝子レベルで改変したDnaA蛋白質を蛍光修飾し、蛍光標識PCR産物との結合をFRETで検出するシステムの開発を目的とし2つのアプローチを試みた。(1)Salmonella EnteritidisのDnaAと蛍光性蛋白質Green Fluorescence Proteinとの融合蛋白質の応用を考案した。融合蛋白質は蛍光を有していたが、細胞内顆粒として発現しリフォールディングは困難であった。(2)DnaAの部分配列を部位特異的変異法で改変し、蛍光修飾箇所を導入するとともに、そのN末端でグルタチオン-S-トランスフェラーゼと融合することにより、グルタチオン固定化マイクロプレートを用いたアッセイ法の構築をめざした。しかしながら、本融合蛋白質も細胞内顆粒として発現したため、それらを回収し、さらにリフォールディングする必要があった。融合蛋白質のCys導入箇所をfluorescein-5-maleimide(F5M)で修飾し、5'末端が6-carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)またはhexachloro-6-carboxy-fluoresceine(HEX)で修飾されたSalomonella由来のoriC断片とを混合することで、F5Mの蛍光の消光が観測され、FRETがDnaA認識配列に特異的に観測できる可能性が示された。
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