| 研究課題/領域番号 |
13650852
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物・生体工学
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| 研究機関 | 独立行政法人産業技術総合研究所 (2002-2003)
北陸先端科学技術大学院大学 (2001) |
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研究代表者 |
横山 憲二 独立行政法人産業技術総合研究所, バイオニクス研究センター, 副センター長 (80242121)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2003年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2001年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
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| キーワード | プロテインキナーゼA / 蛍光共鳴エネルギー転移 / リン酸化 / 固相合成 / 電光色素 / クエンチャー / EDANS / DABCYL / プロテインキナーゼ / dabcyl / MAPキナーゼ / フルオレセイン / ローダミン / FRET |
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| 研究概要 |
蛍光エネルギー転移によるクエンチングを利用した、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の活性をイメージングするためのペプチドの設計を行った。本センサーペプチドは、リン酸化されることによって親水性が高くなり、立体構造変化を起こし、蛍光強度が変化すると考えられる。具体的には、Kemptide配列(LRRASLG)を含む種々のペプチドを用いて、このペプチドのC末端に蛍光ドナーとして、EDANSを、N末端にクエンチャーとして、dabcylを修飾したペプチドを合成した。
合成によって得られた非リン酸化及びリン酸化センサーペプチドの蛍光スペクトルを測定した結果、リン酸化センサーペプチドの蛍光強度は、非リン酸化ペプチドより大きく、顕著な差が見られた。これは、センサーペプチドがリン酸化されることによって、親水性が高くなり、ペプチドが伸びたような構造をとるために、蛍光色素間の距離が離れ、エネルギー転移が起こりにくくなったためであると考えられる。一方、塩基性アミノ酸を伸長させたペプチドでは、反対にリン酸化により蛍光強度が小さくなった。これはリン酸化により、電荷が中和され、それゆえ縮んだ構造になるためであると考えられる。また、PKA反応後のセンサーペプチドのHPLCの溶出時間は、合成によって得られたリン酸化センサーペプチドの溶出時間と一致し、本センサーペプチドは、PKAによってリン酸化されることが確認された。
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