| 研究課題/領域番号 |
13660090
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
鈴木 秀之 京都大学, 生命科学研究科, 助教授 (10202136)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円)
2001年度: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
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| キーワード | グルタチオン / γ-グルタミルトランスフェラーゼ / γ-グルタミルトランスペプチダーゼ / 自己触媒的 / プロセシング / 翻訳後修飾 / プロセッシング |
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| 研究概要 |
大腸菌のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(GGT)遺伝子は、SD配列に続き、25アミノ酸よりなるシグナルペプチド、365アミノ酸よりなる大サブユニット、190アミノ酸よりなる小サブユニットが1つのORFの中にコードされている珍しい構造をとっており、1本のポリペプチド鎖として合成された後、Gln-390とThr-391の間が切断されて、大小2つのサブユニットにプロセスされると考えられた。最近、プリカーサーがプロセシングを受けて成熟し、しかもB鎖のN末アミノ酸残基の側鎖が酵素の活性中心であることが知られている3つのアミドヒドロラーゼの活性中心付近の立体構造が酷似していることが分かり、N-terminal nucleophile hydrolases(Ntn-ヒドロラーゼ)と呼ぶことが提唱されている。これらは前駆体として翻訳された後、自己触媒的にプロセッシングすると考えられている。これまでの報告者の研究からGGTもNtn-ヒドロラーゼに属すると考えられ、GGTも自己触媒的に起こると予想された。GGTの大サブユニットのN末にマルトース結合タンパク(MBP)を融合させるように設計したプラスミドを用いて、MBPを大サブユニットのN末に融合した前駆体酵素分子を精製単離することに成功した。また、T391SおよびT391C変異酵素がプロセシング能は持っているが、その反応速度が極めて遅くなっていることを利用し、それらの前駆体を精製した。これらを用いて、in vitroでプロセシングが自己触媒的におこることを確認した。この自己触媒反応はプロテアーゼ阻害剤やGGT特異的阻害剤によって影響を受けなかった。MBP-GGTやT391Sの前駆体のプロセシング反応にはSH試薬は影響を及ぼさなかったが、T391Cの前駆体のプロセシング反応はpCMBによって、完全に阻害されたことから、プロセシング反応の活性中心もThr-391の側鎖であることが判明した。また、中性付近で反応させるとT391Cの前駆体のプロセシング反応はヒドロキシルアミンによって著しく活性化されたが、MBP-GGTやT391Sの前駆体のプロセシング反応の活性化は顕著ではなかった。このことはプロセシング反応の中間体がエステル型中間体であることを示している。
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