| 研究課題/領域番号 |
13660101
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学・応用生物化学
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
奥 忠武 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20059637)
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| 研究分担者 |
河内 隆 日本大学, 生物資源科学部, 助手 (70339290)
西尾 俊幸 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (10256836)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
2003年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
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| キーワード | ヘムペプチド / 一酸化窒素捕捉 / シトクロム / 紅藻スサビノリ / ウマ心筋 / 大腸菌 / 発現 / 酵素消化 / NOトラップ / 立体構造 / ペプチド精製 / NOトラップ能 / 物理化学的性質 / タンパク質水解 / NO捕捉 |
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| 研究概要 |
【1】ヘムペプチドの大腸菌における発現系の検討および酵素消化による調製
(1-1)ヘムペプチドの大腸菌による発現系の検討
紅藻スサビノリ(P.yezoensis)由来シトクロムc_6遺伝子をPCRにより増幅し、大腸菌MC1061株中でクローニングしたシトクロムc成熟化酵素遺伝子群を挿入したpSTV28ccmA-Hを大腸菌BL21(DE3)に同時形質転換した。ヘリックスIV以降を欠損させたヘムペプチド66(HP66残基)、第六配位子メチオニン58以降を欠損させたHP57(57残基)の発現に初めて成功した。HP57より短鎖のHPの構築も試みたが、成功しなかった。この原因は結合酵素ヘムリアーゼの特性に起因すると考えられ、今後の新課題である。尚、発現量は精製品量でHP66は1.5mg/LおよびHP57は0.7mg/Lと極めて高い値であった。
(1-2)ヘムペプチドの酵素消化による調製
ウマ心筋(市販、104残基)に対して、酵素トリプシンを作用させ、HP9を、キモトリプシンを作用させ、HP22を、HP65は化学試薬臭化シアンを作用させて、それぞれ調製した。
【2】調製ヘムペプチドの一酸化窒素(NO)捕捉能の検討
調製したHPのNOトラップ能について検討した結果、ペプチド鎖が短くなるにつれてHPのNOトラップ能は向上し、最も低分子なHP9のNOトラップ能のk_<cat>(s^<-1>)は1.834であり、Cyt c (k_<cat>(s^<-1>)=0.015)の約120倍のNOトラップ能を示した。これまでに、人工的に合成されたNOトラップ分子は多数開発されているが、本研究のように天然分子から低分子化した分子が、極めて秀れたNOトラップ能を示したという報告は全くなく、本研究が最初の成功例である。
以上の結果から、3年間の本研究が、ほぼ所定の目的を達したものといえる。
本成果を踏まえて、本研究で調製したHPを用いたNOの調節について検討を行う事が今後の研究課題であろう。
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