| 研究課題/領域番号 |
13660172
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
水産学一般
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
李 大雄 北海道大学, 大学院・水産科学研究科, 助手 (60210811)
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| 研究分担者 |
森 司 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (60241379)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2002年度: 700千円 (直接経費: 700千円)
2001年度: 2,500千円 (直接経費: 2,500千円)
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| キーワード | 造雄腺 / 造雄腺ホルモン / 甲殻類 / オニテナガエビ / 十脚目 / エビ / 性分化 |
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| 研究概要 |
本研究はオカダンゴムシの造雄腺ホルモン(AGH)の遺伝子情報を基に、同じ軟甲亜綱であるオニテナガエビにおけるAGH遺伝子のスクリーニングとその作用機構の解明を目的とした。また、研究方法の基礎として、眼柄除去による造雄腺肥大化によりAGH遺伝子が確実に発現する造雄腺を確保する方法も開発した。
眼柄除去後2〜3週間経過すると、造雄腺が10〜30倍肥大することが磁認された。また、造雄腺移植実験の結果から、その肥大した造雄腺はAGH遺伝子が発現していることが示唆された。
オニテナガエビの正常と肥大化の造雄腺などの材料からTotal RNAを抽出し、RNAを増幅させてcDNAライブラリーの作成や3'-RACEなどを行いAGH遺伝子のスクリーニングを試みた。また、オカダンゴムシAGH遺伝子やオニテナガエビAGH遺伝子断片をプローブとしてオニテナガエビ造雄腺のin situハイブリを試みたが、造雄腺を肥大させた個体を用いたノーザンハイブリダイゼションでもAGH遺伝子の発現を検出することはできなかった。
そのためSP6,T7を結合させたプライマーを合成して、これを用いてRNAからcDNAを合成できるシステムを構築し、AGH遺伝子の増幅を試みた。次にオカダンゴムシのAGH遺伝子の塩基配列を基に幾つかのプライマーを合成し、PCRを行った結果、360bpの遺伝子を得ることが出来た。この遺伝子のオカダンゴムシAGH遣伝子との相同性は84.16%であったが、ダンゴムシ遺伝子のB chain, C peptideでは1塩基しか違いが無いが、A chainからは28.2%の相同性しか無かった。アミノ酸配列に変換して比較した場合、B chain, C peptideでは100%相同であたったが、A chainでは26残基中1残基しか相同ではなかった。また、このオニテナガエビはゲノム上にT7と全く相同な8-9bpの塩基配列を有するためT7を用いてPCRやcDNA合成反応を行うとゲノムに存在しているAGH遺伝子のコンタミを起こすことが明らかになった。そのため、SP6を用いた反応系により作成したcDNAを鋳型にしてPCR反応を行うことにより発現しているAGH遺伝子のパーシャルなクローニングが出来た。
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