| 研究課題/領域番号 |
13660330
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用獣医学
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| 研究機関 | (財)日本生物科学研究所 |
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研究代表者 |
岩田 晃 (財)日本生物科学研究所, 研究部, 主任研究員 (70193745)
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| 研究分担者 |
金井 朋子 (財)日本生物科学研究所, 研究部, 研究員 (10300790)
山元 哲 (財)日本生物科学研究所, 研究部, 研究員 (40290986)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,300千円 (直接経費: 3,300千円)
2002年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2001年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
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| キーワード | イヌ / パルボウイルス / 治療 / CDR移植 / イヌ化 / 中和 / モノクロナール抗体 / Contact法 / パルボウィルス / モノクローナル抗体 |
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| 研究概要 |
(1)イヌパルボウイルス(以下、CPV)に対する中和モノクローナル抗体の作製とcDNAクローニング
CPVをCRFK細胞で増殖し、密度勾配超遠心法で精製した。これを抗原として、マウスを免疫し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマはELISA、間接蛍光抗体法、中和能でスクリーニングし、最終的に6クローン(CP1a〜6a)を単離した。このうち、IgG1サブタイプであり、CPVに対する結合性の高いCP3aを選んでRNAを抽出し、PCRにより免疫グロブリン(Ig)H鎖、L鎖cDNA両方をクローニングし、塩基配列を決定した。
(2)イヌIgcDNAクローニング
ビーグル犬の脾臓細胞よりRNAを調製し、既知の塩基配列をもとにPCR法によりイヌIgcDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。イヌIgγ鎖4クローンは約470アミノ酸からなっていた。定常領域のアミノ酸配列の比較から、ヒトもしくはマウスIgγ鎖とは60-70%の相同性であった。また、κ鎖は242アミノ酸からなるクローンが得られ、ヒトもしくはマウスIgκ鎖とは58%の相同性であった。λ鎖は231アミノ酸からなり、ヒトもしくはマウスIgγ鎖とはそれぞれ85、73%の相同性であった。
(3)抗原結合部位(CDR)移植によるイヌ化抗体の作製
CP3a抗体の可変領域の塩基配列よりContact法に従ってCDRを推定した。また、同様にイヌ抗体の可変領域について推定した。CP3a抗体のCDRをイヌの予想されるCDRの代わりに交換したイヌ化抗体可変領域をH鎖、L鎖両方について設計し、イヌ抗体可変ドメインに相当するDNA断片を全合成した。これらをそれぞれ相当するイヌH鎖、L鎖の定常領域遺伝子と結合し、1つのバキュロウイルスへのトランスファーベクターに組み込み、Sf21細胞を用いて組換えバキュロウイルスを作成した。組換えウイルス感染細胞の培養上清中に、イヌ抗体の発現タンパク質が抗イヌIg抗血清を用いて検出された。
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