| 研究課題/領域番号 |
13660344
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用分子細胞生物学
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| 研究機関 | 国立がんセンター研究所 |
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研究代表者 |
渡辺 雅彦 国立がんセンター, 研究所・がん予防研究部, 室長 (00182949)
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| 研究分担者 |
若林 敬二 国立がんセンター, 研究所, 副所長 (60158582)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2002年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
2001年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | モンシロチョウ / ピエリシン / ADPリボシル化 / DNA付加体 / 細菌毒素 / ADP-リボシル化 |
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| 研究概要 |
モンシロチョウに存在するがん細胞傷害性蛋白質、ピエリシンは、分子量約98,000の蛋白質であり、コレラ毒素等のADP-リボシル化酵素と相同性を示す。ADP-リボシル基転移反応のターゲット分子の検索を行うため、ピエリシンとHeLa細胞粗抽出液を^<32>P-NADの存在下反応させ、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、オートラジオグラフィーを行ったところ、高分子量画分に^<32>Pの取り込みが観察された。しかしながら、この高分子画分は、プロテアーゼによって分解されない一方、ヌクレアーゼに感受性を示した。このことから、ピエリシンのターゲット分子は、これまで知られているADPリボシル転移酵素とは全く異なり、DNAであることが推察された。さらに、塩基配列との関連を調べたところ、グアニン塩基の存在と取り込み量が強く相関していた。2'-Deoxyguanosineを受容体分子としてピエリシンとNADを加え反応を行い、反応生成物の紫外吸収スペクトルおよびESI-MS解析を行ったところ、ADPリポシル化dGであることが示唆された。さらに^1H-NMR,^<13>C-NMR,2D-COSY, HMQC解析を行い、その構造をαおよびβ体のN^2-(ADP-ribos-1-y1)-2'-deoxyguanoslneであると推定した。続いて別途合成を行い、最終的に反応生成物の構造を決定した。ADPリボシル基の受容体として高分子二本鎖DNAを用いた場合でも、グアニン塩基の同じ位置がADPリボシル化されることを^1H-NMR等を用いて確認した。この付加体は、ピエリシン-1処理したHeLa細胞のDNAにも存在することを、^<32>P-ポストラベル法により確認した。以上より、ピエリシン-1により細胞内DNAのグアニン塩基がADPリボシル化されて傷害を受けることにより、細胞がアポトーシスを起こすことが推察された。
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