| 研究課題/領域番号 |
13670128
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
医化学一般
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
中村 史雄 横浜市立大学, 医学部, 講師 (10262023)
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| 研究分担者 |
小倉 顕一 横浜市立大学, 医学部, 助手 (20326028)
佐々木 幸生 横浜市立大学, 医学部, 講師 (10295511)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
2002年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
2001年度: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
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| キーワード | チロシンホスファターゼ / セマフォリン / プレキシン / 神経回路形成 / 細胞内情報伝達 / チロシンリン酸化 |
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| 研究概要 |
Plexin-A4に会合するチロシンリン酸化タンパク質:mycエピトープを付加したPlexin-A4をラット胚17日齢初代大脳皮質培養神経細胞に発現させ、抗myc抗体により免疫沈降した。100kDaのタンパク質がPlexin-A4に会合し、Sema3A刺激後にチロシンリン酸化された。このリン酸化は一過性であり、刺激後数分でピークに達し、その後速やかに減弱する。現在、100kDa分子の同定を行っているが、回収されるタンパク質量が少なく未だ同定に至っていない。Plexin-Aの情報伝達に関与するFESやFYNはPlexin-A4に会合していたが、100kDaとは異なる大きさを示した。
PTPδに会合するチロシンリン酸化タンパク質:ニワトリあるいはマウス初代大脳培養神経細胞から抗PTPδD2領域抗体を用いてPTPδを含むLAR型PTPを免疫沈降した。その結果、100kDaチロシンリン酸化タンパク質が免疫共沈していた。このタンパク質はSema3A刺激後に脱リン酸化される傾向にあった。また免疫沈降後にホスファターゼ阻害剤を除き37℃で反応させると100kDaのリン酸化量が減弱したことから、LAR型PTPの基質になると考えられた。Plexin-A4に結合する分子と併せて、この分子の同定を試みている。
PTPδの基質分子の検索:PTPδのsubstrate trap変異体、及びFYNを用いた酵母ハイブリッド法により、プリン代謝に関与する酵素ADE2(AIRC)を得た。ADE2はFYNと会合しリン酸化されるが、FYNの活性を変化させなかった。
PTPδ細胞外領域に結合する分子の検索:細胞外領域をアルカリホスファターゼ(AP)標識した融合タンパク質(APδex)を用い、PTPδの細胞外領域が結合する組織や培養神経細胞に与える影響を検討した。APδexはマウス胚大脳皮質の皮質下領域、反屈束、延髄に結合が認められた。またAPδexは同時期のマウス胚大脳皮質培養細胞の突起伸展を促進した。
Sema3A刺激に伴う遺伝子発現:ラット大脳皮質分散培養細胞を作成し、Sema3A刺激を行い1時間後にRNAを抽出した。ラット脳に発現する約9000遺伝子のアレイを用いて解析した。27個の遺伝子がSema3A刺激により10倍以上の増減を示した。この中から9個のRealTime-PCRによる定量を試み、PKA regulatory subunit stannin、HA1R-62の3つの遺伝子のmRNAがSema3A刺激により増加することがわかった。
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