| 研究課題/領域番号 |
13670135
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
病態医化学
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
岡野 幸雄 岐阜大学, 医学部, 教授 (10177066)
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| 研究分担者 |
木村 正志 岐阜大学, 医学部, 助手 (40260575)
吉岡 孝 岐阜大学, 医学部, 助手 (20311699)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,500千円 (直接経費: 3,500千円)
2002年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
2001年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | UBE2E2 / yeast two-hybrid / ARA54 / RNF8 / RING-finger / RXR / dominant negative / nuclear localization / FRET / RING-finger蛋白 / ユビキチン化 / リン酸化 / レチノイド誘導体 |
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| 研究概要 |
N末伸長型ユビキチン付加酵素(E2)をbaitとしたyeast two-hybrid screeningによって数個の陽性クローンを得た。この中でARA54とRNF8について解析した。これらの遺伝子はRING-fingerタンパク質をコードしており、baitに用いたUBE2E2と特異的に相互作用した。ARA54とRNF8は、細胞内で発現させると、プロテアソーム阻害剤で発現が亢進し、HA-ユビキチンとの同時細胞内導入によってユビキチン化(Ub化)されることを明らかにした。また、大腸菌や昆虫培養細胞に発現させたタンパク質を用いてin vitroでもUb化されることを示し、E3として作用することを明らかにした。ARA54はアンドロゲン受容体(AR)と会合することが報告されているが、ARのUb化に関与するとの証拠は得られなかった。また、ARA54とRNF8の細胞内局在を明らかにした。
我々は、RNF8がステロイド受容体スーパーファミリーの1つであるRXRと会合することを明らかにした。RNF8及びRXRの部分欠失遺伝子を構築し、two-hybrid assayにより両者のいずれもN末で会合することを明らかにした。RNF8は自己Ub化されてE3として作用するが、RXRを標的とするとの結果は得られなかった。しかし、UBE2E2によってRXRのUb化は亢進し、このE2が作用することが示唆された。一方、RNF8は、RXRの転写活性を有意に亢進させた。この転写活性化作用はリガンドの有無に関係なく、RNF8のN末欠失変異(ΔN)やRING構造を壊した変異タンパク質(DN)では活性化を認めなかった。さらに、RNF8のwild typeは核に局在するが、ΔNやDNは核に局在しないことが明らかとなった。
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