| 研究課題/領域番号 |
13670521
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
消化器内科学
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
茶山 一彰 広島大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (00211376)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2003
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| 研究課題ステータス |
完了 (2003年度)
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| 配分額 *注記 |
3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
2003年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
2002年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
2001年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
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| キーワード | HCV / RT-PCR / クローニング / HCV infectious clone / IFN / HCV infectiousclone / IFN-β / RNA interference / IRFファミリー / polymerase / helicase / protease / polymerase chain reaction |
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| 研究概要 |
平成14年度には、C型急性肝炎患者血清を用いて、HCVの全領域の遺伝子をRT-PCRにより増幅し、direct sequence法で全塩基配列の決定を行い、クローニング、変異導入を行った。H15年度には、それぞれのクローンを連結してdirect sequenceと一致するHCVクローンを作製し、PBR322にHCV全長、T7プロモーター、HDVリボザイムが挿入されたコンストラクト(HCV infectious clone)を得た。さらに、T7 RNA polymerase発現ベクターをキュアード細胞にstable transufectionし、HCV infections cloneをstable transfectionしてHCV持続発現細胞株の作製を試みている。また、HCV infectious cloneをRNAに転写し、その転写産物を、in vivoで投与を行いHCV複製について血清のRT-PCR、肝組織の免疫染色などにより感染性の検討を行っている。
平成14年度には、E2、NS5A蛋白を恒常的に発現する細胞株を作るために、IFN抵抗性のC型肝炎患者のE2、NS5Aをインフルエンザウイルスベクターに組み込んで、293T細胞、MDCK細胞に感染させて蛋白発現を試みたがE2およびNS5A共に蛋白発現が低かった。そこで、平成15年度には、上記のHCVinfectious cloneの各領域(core、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS5A、NS5B)を真核細胞発現ベクター(pKS366)に組み込んだ。それらをHuh7細胞にtransfectionし、各領域の蛋白発現細胞を作製し、蛍光抗体および免疫沈降により各領域の蛋白発現を確認した。さらには、各領域がpKS336に組み込まれたプラスミドとIFN-β promoter-Luciferaseプラスミドをco-transfectionし、Polyl : Cで刺激し、IFN-βの産生に対する影響について検討を行っている。
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