| 研究課題/領域番号 |
13670648
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
神経内科学
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
川端 昌弘 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (30204762)
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| 研究分担者 |
秋山 公佑 (秋山 公祐) 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (30222540)
川端 晃幸 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (60201448)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
2002年度: 1,900千円 (直接経費: 1,900千円)
2001年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | Trad / Rad51d / RecA / Rad51 / recombination / repair / Rad51D |
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| 研究概要 |
神経変性疾患の発症機序の一つとしてDNAの欠失や変異が蓄積して変異タンパク質により細胞機能が傷害されて神経細胞死が起こることが考えられている。神経細胞が長期にわたり生存し、正しく機能するためには、細胞の機能を司るタンパク質をつくる遺伝子に傷害がないことがきわめて重要である。本研究計画では、この点に着目して、私たちが発見し、Tradと命名したDNA修復タンパク質がDNA損傷による神経細胞死にどのように関与しているかを明らかにするための検討を行った。私たちはすでにこの修復タンパク質mRNAが脳で高い発現が認められることを見出しており、中枢神経細胞で重要な役割を果たしていることが示唆されている。
すでに作成していたTradのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質に対する抗体をウエスタンブロッティング法で特異性の確認をしたところ、複数のバンドが確認された。新たに作成した4カ所の抗ペプチド抗体を用いて、特異性を検討するため、遺伝子のクローンニングがなされているマウスRAD51/recA familyすべてのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質を作成し、発現誘導を行い、ウエスタンブロット法により各々の抗体で検出を行ったところ、組換えGST融合Trad蛋白質に対する特異性は低く、組換えGST融合Trad蛋白質に対する抗体価も低いことが示された。そこでTrad蛋白質に対する新たな抗ペプチド抗体を作成し、同様にRAD51/recA familyに対する特異性を検討したところ、組換えGST融合ヒトTrad蛋白質や他のマウスRAD51/recA family蛋白質とはクロスせず、組換えGST融合マウスTrad蛋白質に特異的な高力価の抗体であることが示された。この抗体を用いてマウス培養細胞や各組織のウエスタンブロット法による検討を行ったところ、Trad蛋白質の発現レベルは極めて低く、複数のバンドが検出された。このことは私たちが既に報告しているノザンブロットの結果およびヒトに於ける複数のスプライスバリアントの存在を裏付けるものと考えられた。
ヒトにおいては複数のスプライスバリアントがあることを報告しているので、マウスにおいても同様のバリアントがあるか検討を行い、複数のバリアントを確認した。これらバリアントをマウスで発現させ表現型を検討するため、テトラサイクリンで発現を制御できるウイルスベクターに各バリアントを組込み、高力価のウイルス上清を作成した。
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