| 研究課題/領域番号 |
13671250
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
外科学一般
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
宮崎 国久 自治医科大学, 医学部, 助手 (10260837)
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| 研究分担者 |
李 小康 国立成育医療センター研究所, 移植・外科研究部, 室長 (60321890)
小西 文雄 自治医科大学, 医学部, 教授 (20142242)
遠山 信幸 自治医科大学, 医学部, 講師 (10265283)
木村 広光 国立成育医療センター研究所, 移植・外科研究部, 室長 (80115477)
森 康昭 自治医科大学, 医学部, 助手 (00254938)
足立 健介 自治医科大学, 医学部, 助手 (90285809)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2001年度: 2,000千円 (直接経費: 2,000千円)
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| キーワード | アデノウイルスベクター / IDO / トリプトファン / 臓器移植 / Cre / loxP / XS106 / 樹状細胞 / 遺伝子治療 / lentivirus vector / apoptosis / 膵頭移殖 / RCAS-1 / キヌレニン |
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| 研究概要 |
本研究では、(1)loxP配列を持つON/OFF系IDOアデノウイルスベクターをCOS-TPC法を用いて作製した。作製したCre/loxP系を用いたアデノウイルスベクターAxCALNIDOおよびCre組み換え酵素発現用ベクターAxCANCreを共感染させたCOS-7細胞ではIDOがWestern blotで確認した。生体内の肝臓でのIDO遺伝子の発現も認められた。(2)ラットDCの大量培養、純化及び遺伝子導入の検討について、GM-CSFを添加しない方法、即ちFlt-3/Flk-2+IL-6を用いたラット骨髄細胞からのDCの分化・培養法を確立した。GM-CSF+IL-4を添加する方法と比較して、培養開始後3週間くらいで採取してきた骨髄細胞数の10〜20%に相当する数のDCはサイトスピン像とFACSで同定し、DCであることを確認した。また、ラットmature DCのpurificationの方法について、得られたラットDCをNKR-PlA(CD161a,C型レクチン)にてautoMACSでpositive selectionを行なうと、ほぼ100% mature DCのみにpurifyすることができた。さらに、Adenovirus、Lentivirusに組み込んだEGFPを用いて、DCへの遺伝子導入を試み、導入率、細胞毒性等の検討により、Rat DCへの遺伝子導入にはLentivirusを使用するのがベストと考えられた。(3)AxCALNIDOをA/Jマウス由来樹状細胞(XS106)に感染させ、リンパ球の活性を抑制するか否かをMixed lymphocyte reaction(MLR)を用いて検討した。MLRの結果から、AxCALNIDOを感染させた群は、コントロール群であるAdxCre群に比べ、24時間および48時間ともにリンパ球の増殖が抑制されていた。このことにより、DCにIDOを発現させることで、リンパ球の活性を抑制することが明らかとなった。また、その作用機序として、cell cycleの制御及びapoptosis誘導についてFACSにて検討を行い、細胞死の誘導によるリンパ球の活性抑制が示唆された。(4)ラット膵島移植モデルを用い、AxCALNIDO導入後の拒絶反応抑制効果について検討を行った。明らかなグラフト延長効果が得られなかった。その機序について検討中である。さらに現在、ドナーにAxCALNIDOを感染させたXS106導入したC57BL/6Cr Slcマウス、レシピエントにA/Jマウスを用いて頚部心移植を行い、拒絶反応抑制効果が認められるかを検討中である。
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