移植医療に向けた、膵島細胞分化経路の解明

• 研究課題/領域番号: 13671268
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 外科学一般
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 小野 順子 福岡大学, 医学部, 教授 (40108692)
• 研究分担者: 勝田 仁 福岡大学, 医学部, 助手 (50333240) ; 安西 慶三 福岡大学病院, 講師 (60258556) ; 安波 洋一 福岡大学, 医学部, 助教授 (00166521)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2002年度: 1,300千円 (直接経費: 1,300千円); 2001年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
• キーワード: 膵島細胞 / 遺伝子発現 / 分化誘導 / cre-loxP system / インスリン / グルカゴン

研究概要

近年、糖尿病の治療に、膵臓または膵島の移植、遺伝子治療、人工膵臓などを定着させるためには、膵島細胞の分化・増殖を誘導する技術の確立が急務である。本研究で、まず膵島細胞の誘導に適した細胞を選択するために、膵島細胞の正確な分化経路の解明を試みた。その手段として、個々の細胞が前駆細胞の段階で、ある特定の遺伝子を発現したか否かを検定するために、新たにcre-loxP systemを応用し、マウスから単離した膵島細胞において、'前駆細胞遺伝子発現検定法を考案した。
この検定法を用い、まずインスリン遺伝子の発現を指標として膵島細胞の分化経路を解析している。はじめにインスリン遺伝子のプロモーターを有するcre遺伝子の発現ベクターを構築し、トランスジェニックマウスを作製した。このマウスでは、cre遺伝子がインスリン産生細胞特異的に発現していることを、RT-PCRおよび抗cre抗体を用いた免疫組織化学染色により確認した。次に、動物細胞で普遍的に活性化するCAGプロモーターの直下にloxP配列で挟んだ転写終止カセットを挿入し、cre recombinaseの非存在下では発現しないよう制御されたEGFP遺伝子(レポーター)の発現ベクターを構築し、トランスジェニックマウスを作製した。この2つのマウスを交配し、ダブルトランスジェニックマウスを作製した。サザンブロット法を用い、このマウスの膵島において、loxP配列の組み換えが起こり転写終止カセットが切り出されていることを確認した。
現在、このダブルトランスジェニックマウスの膵島において、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡等を用いてEGFPの発現を検定し、いかなる細胞が、インスリン陽性細胞から派生したかを解析している。今後、同様にグルカゴン、ソマトスタチン、PPについても解析し、膵島細胞の分化経路を解明して行く予定である。