| 研究概要 |
ニワトリ輸卵管より調製した卵白中の糖タンパク質であるα_1-酸性糖タンパク質(chickenα_1-AGP)遺伝子のクローニングを行い、chickenα_1-AGPのアミノ酸配列を明らかにした。chickenα_1-AGPタンパク質は、リシルエンドペプチダーゼ、トリプシンおよび臭化シアンを用いて、それぞれ特異的にペプチド結合を切断し、得られたペプチド断片の部分アミノ酸配列をもとに、BLASTホモロジー検索から4つの相同性のあるESTを得た。それらの配列から適切なプライマーを製作し、ニワトリ輸卵管のcDNAからPCRにより、chickenα_1-AGP遺伝子を得た。PCRで増幅した620bpのDNA配列中に、203残基のアミノ酸からなるORFが存在した。相同解析およびchickenα_1-AGPタンパク質のペプチド断片のN-末端アミノ酸分析結果から、卵白中のα_1-AGPは183残基のアミノ酸からなり、2個のS-S結合をもつことが明らかとなった。次に、MALDI-TOFMSによりchickenα_1-AGPのS-S結合および糖鎖結合位置を明らかにした。chickenα_1-AGPにEndo F/PNGase Fを作用させ、糖鎖を完全に水解したchickenα_1-AGP(cd-chickenα_1-AGP)を調製した。cd-chickenα_1-AGPを2 M ureaを含む100mM NH_4HCO_3緩衝液に溶解し変性後、トリプシン消化を行なった。得られたトリプシン消化物の分子量をMALDI-TOFMSを用いて測定し、S-S結合の位置を決定した。cd-chickenα_1-AGPを100mM NH_4HCO_3緩衝液に溶解し、10mM DTTおよび10mM CH_2ICONH_2で還元アルキル化後、トリプシン消化を行なったのち、MALDI-TOFMSおよびシークエンサーを用いて糖鎖結合位置を決定した。cd-chickenα_1-AGPの変性後のトリプシン消化物において、3037.3(ペプチド69-76,161-183)および3453.3(ペプチド69-80,161-183)の[M+H]^+イオンが検出されたことより、S-S結合の位置はCys6とCys146およびCys73とCys163であることがわかった。また、N-アセチルグルコサミンが付加したペプチド、AsnがAspに変換されたペプチドに由来するイオンが検出されたことから、糖鎖の結合位置はAsn16,62,70,77,87であることがわかった。また、62位の糖鎖が欠如したchickenα_1-AGPも存在することがわかった。
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