| 研究課題/領域番号 |
13672375
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
人類遺伝学
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
山添 光芳 京都大学, 医学研究科, 助手 (00284745)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2001年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
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| キーワード | BRCA2 / 相同DNA組み換え / 染色体安定性 / DT40細胞 / 条件変異株 / Cre-loxP組み換えシステム / 条件特異株 / Rad51パラログ / gene targeting / コンディショナル変異体細胞 / Cre-loxP組換えシステム |
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| 研究概要 |
1.遺伝子ターゲッティングによってBRCA2遺伝子座に以下のアレルを様々な組み合わせで導入した。
(1)完全欠失のアレル(null)
(2)コンディショナルな欠失アレル(con)
(3)C末端領域が欠失した変異アレル(tr)
2.BRCA2条件欠失株の作製と表現型の解析
BRCA2の条件欠失細胞(null/con)からBRCA2を欠失させると、細胞は増殖を停止し致死となった。
このことからBRCA2は細胞増殖に必須であることが明らかとなった。
3.BRCA2部分機能欠損株の作製と表現型の解析
BRCA2のコンディショナルヘテロ細胞(con/tr)から以下の2種類のBRCA2の部分機能欠損株を作製した。
(1)中央の8個のアミノ酸繰り返し配列(BRCリピート)のうち3番目のBRCリピート以降のC末端を欠く変異BRCA2の発現株(ERC3)
(2)C末端の核移行シグナルを欠く変異BRCA2の発現株(ΔNLS)
<表現型の解析>
(i)細胞増殖能
ΔNLSは野生型細胞と同じ速度で増殖したが、BRC3は倍加時間が正常と比べて1.25倍長くなっていた。
(ii)DNA損傷に対する感受性
ΔNLSではシスプラチンに対する感受性が亢進しており、BRC3ではシスプラチンや電離放射線に対する感受性が亢進していた。
(iii)DNA損傷後のRad51フォーカス形成
BRC3では電離放射線照射後の核内Rad51フォーカス形成が観察されなかった。
(iv)遺伝子変換効率と遺伝子ターゲッティング効率
BRC3では両者とも野生型細胞に比べて顕著に低下していた。
以上の結果よりBRCA2は相同DNA組み換えに関与しており、DNA損傷時にRad51のDNA損傷部位への招集を促進していると考えられた。
4.今後の展開について
(1)BRCA2のN末端およびC末端に存在する保存領域の機能を調べるために、それぞれの領域が欠失したBRCA2変異株を作製し表現型を解析する。
(2)Rad51パラログとのエピスタシスを明らかにするために、BRC3変異とパラログ遺伝子欠失変異との二重変異株を作製する。
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