アンチセンスオリゴヌクレオチド遺伝子治療適正化を目的とした血漿中濃度推移解析

• 研究課題/領域番号: 13672386
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 応用薬理学・医療系薬学
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 奥村 勝彦 神戸大学, 医学部附属病院, 教授 (60025707)
• 研究分担者: 竹島 泰弘 神戸大学, 医学部附属病院, 助手 (40281141) ; 栄田 敏之 神戸大学, 医学部附属病院, 助教授 (00304098) ; 松尾 雅文 神戸大学, 医学部, 教授 (10157266)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 3,400千円 (直接経費: 3,400千円); 2002年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円); 2001年度: 1,700千円 (直接経費: 1,700千円)
• キーワード: 筋ジストロフィー / 遺伝子治療 / アンチセンス / 血中濃度 / HPLC / リアルタイムPCR

研究概要

申請者らは、難病の一つであるデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対して、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(アンチセンスODN)を用いた遺伝子治療を行う機会を得た。そこで、本遺伝子治療の適正化を目的として、まず、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)法およびリアルタイムPCR法によるアンチセンスODN定量法を確立した、次に、HPLC法を用いて、アンチセンスODN投与製剤の安定性を評価すると共に、アンチセンスODN血漿中濃度測定を可能とした。以下に研究成果を示す。
1.HPLC法(LC10A(島津製作所))は、移動相が0.1Mトリエチルアミン(pH80):アセトニトリル(55:45→95:5)、カラムがODS (SG300(資生堂))からなる逆相系とした。その結果、高感度(測定限界値:0.5μg/ml)かつ良好な線形性(r^2>0.993)が得られた。また、リアルタイムPCR (ABIPRISM 7700 (ABI))法では、Tm値の高いアンチセンスODNの場合、再現生が低く、線形性が悪かったが(r<0.02)、PCRの反応液組成および反応温度・時間を変更することによって、これらは改善された(r=0.747,測定限界値:0.05μM)。
2.HPLC法により、アンチセンスODN投与製剤(10mg/ml生理食塩水)の安定性を評価した。保存条件を遮光・露光下、室温・冷所・凍結として検討した結果、遮光下、冷所保存において最も長期間(5ヶ月間)安定であった。一方、露光により分解物生成が確認された。また、溶媒として蒸留水、Tris-EDTA緩衝液、5%ブドウ糖液を用いた製剤では、いずれも調製後24時間は安定であった。
3.HPLC法によるアンチセンスODN血漿中濃度測定法では、血漿からのアンチセンスODNの抽出率を向上させるため、内標準物質としてアンチセンスODNに対して相補的な配列を含んだODNを用いた。その結果、血漿抽出率は90%以上になり再現生も良好となった。本抽出法は、従来行なわれているフェノール抽出と比較して簡便かつ高感度であった(測定限界値:0.5μg/ml)。
以上の結果より、簡便かつ高感度なアンチセンスODN測定系が確立できた。本測定系は、アンチセンスODNの製剤評価ならびに血漿中濃度モニタリングを可能とすることから、アンチセンス遺伝子治療を行う上で、非常に有用であると考えられた。