| 研究課題/領域番号 |
13680692
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
堀 弘幸 愛媛大学, 工学部, 助教授 (20256960)
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| 研究分担者 |
澤崎 達也 愛媛大学, 工学部, 助手 (50314969)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
3,200千円 (直接経費: 3,200千円)
2002年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2001年度: 1,800千円 (直接経費: 1,800千円)
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| キーワード | 無細胞翻訳系 / 多波長異常分散 / セレノメチオニン標識 / X線結晶構造解析 / RNA修飾酵素 / 翻訳 / 多波長異常分散法 / セレノメチオニン |
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| 研究概要 |
無細胞翻訳系によるセレノメチオニン(SeMet)標識を、クラゲ蛍光タンパク質(GFP)および菌ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をモデルタンパク質として検討した。その結果、いずれのタク質も、メチオニン(Met)を用いた通常の合成量に匹敵する量で合成が可能であった。合成したパク質中のSeMet置換は、液体クロマトグラフィ-質量分析により確認した。全液体クロマトグを精査しても、内在性Metによる該当ペプチドを検出できなかったことから、SeMet置換量は100%に近いことが確認された。また、この過程でSeMet標識タンパク質を、-80℃で6ヶ月間してもSeMet基が酸化を受けないことも確認された。
GFPの発色団形成は、通常のメチオニン標識よりもややスローであったが、その蛍光スペクはSeMet-GFPとMet-GFP間でよい一致をしめした。この結果は、少なくとも発色団近傍のタク質立体構造形成にSeMet標識が何も影響を与えないことを示している。また、DHFRの場合、残基の位置が触媒機構上重要なMet20-ループに含まれることから、触媒活性への影響が懸念さが、これもほぼ同等の活性を有することが確認された。
これら、モデルタンパク質による標識の検討を終え、X線構造解析に着手しているtRNA修飾のSeMet導入部位検索に利用した。現在、本酵素は1.5Å解像度で構造精密化を行なっている。
よって、無細胞翻訳系により、高効率でSeMet標識が可能であることが確認され、x線結晶構造解析への応用が可能なものと考えている。本研究の一部は、日本生化学会および分子生物学会において発表し、解析中の遺伝子のクローニングおよびドメイン構造、活性に必須なアミノ酸残基についてはすでにいくつかの論文として公表した。構造解析の詳細については、平成15年度以降、順次、論文として発表する予定である。
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