古細菌由来アミノアシル-tRNA合成酵素の構造とtRNA認識機構の解明

• 研究課題/領域番号: 13680705
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 機能生物化学
• 研究機関: 山形大学
• 研究代表者: 長谷川 典巳 山形大学, 理学部, 教授 (60095023)
• 研究分担者: 久野 敦 山形大学, 理学部, 助手 (50302287)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 3,500千円 (直接経費: 3,500千円); 2003年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円); 2001年度: 1,500千円 (直接経費: 1,500千円)
• キーワード: tRNAアイデンティティー / 古細菌 / Aeropyrum pernix K1 / アミノアシル-tRNA合成酵素 / 進化 / トレオニンtRNA / プロリンtRNA / トリプトファンtRNA / Aeropyrum pernix / トリプトファニル-tRNA合成酵素 / トリプトファンRNA / 分子進化 / チロシル-tRNA合成酵素 / チロシンtRNA / in vitro転写反応 / プロリル-tRNA合成酵素 / T7RNAポリメラーゼ

研究概要

tアイデンティティー要素は、大腸菌を含めた真正細菌の系では広く研究されているが、第三の生物界と考えられる古細菌の系についての研究は少ない。そこで、超好熱古細菌であるAeropyrum pernix K1由来のトレオニン、プロリンおよびトリプトファンtRNAについてのアミノアシル-tRNA合成酵素による分子認識機構を解明するために、これらの酵素をクローニングし、大量発現する系を確立した。In vitroでの転写反応によって、野生型および各種変異体を作製し、アミノアシル化反応を追跡することで、これらのアミノ酸種tRNAの認識部位の解明を行った。トレオニンの系では、先に我々が大腸菌のトレオニンtRNAは識別位塩基を認識しない唯一の例であることを証明したが、古細菌のA.pernixでも認識されていなかった。この結果は同じ古細菌である好塩菌の場合と異なり、古細菌界でも異なった認識の進化をしているものと考えられた。トレオニンtRNAの認識部位は、アンチコドンの他は、アクセプターステム末端領域に集中しており、これらの認識部位は、プロリンtRNAを母体としてアンチコドンとアクセプターステム末端領域をトレオニンタイプに移植することにより、アミノ酸受容特異性のスイッチングが起こり、認識部位として証明することができた。プロリンの系については、アンチコドンと識別位塩基の認識については大腸菌の系と同じであったが、アクセプターステム末端のG1-C72の認識が重要であり、この部位の認識は大腸菌と決定的に異なり、真正細菌、真核生物、古細菌間で認識部位が異なっていることを証明することができた。トリプトファンの系については、プロリン同様アンチコドンと識別位塩基の認識については大腸菌の系と同じであったが、アクセプターステム末端のG1-C72の認識が重要であり、大腸菌のA1-U72の認識部位とは異なっていた。A.pernixのこれら3種類のアミノ酸種tRNAについて、いずれの場合も大腸菌とは異なった認識パターンをもち、A.pernixの進化について考える重要な手がかりが得られたものと考えることができる。

研究成果

• [文献書誌] Yokozawa, J., Hasegawa, T.et al.: "Recognition of tRNA by aminoacyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 1. 117-118 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Fukuda, K, Hasegawa, T. et al.: "Construction of the dual-functional RNA ligand against HCV protease and helicase."Nucleic Acids Research Supplement. 1. 147-145 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Hasegawa, T.et al.: "Molecular recognition of threonine tRNA by threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 81-82 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Taki, M., Hasegawa, T.et al.: "A novel fluorescent nonnatural amino acid that can be incorporated into a specific position of streptavidin."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 203-204 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Iwaki, J., Hasegawa, T.et al.: "Differences in tyrosine tRNA identity between Escherichia coil and archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 225-226 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kikuchi, K, Hasegawa, T. et al.: "In vitro selection of RNA aptamers that bind to domain II of HCV IRES."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 267-268 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Hasegawa, T.et al.: "Evolution and tRNA recognition of threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Viva Origino. 31・1. 62-70 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kikuchi, K., Hasegawa, T.et al.: "RNA aptamers targeted domain II of hepatitis C IRES could bind its apical loop region."Journal of Biochemistry. 133・3. 263-270 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kikuchi, K., Hasegawa, T.et al.: "Structure-inhibition analysis of RNA aptamers that bind to HCV IRES."Nucleic Acids Research Supplement. 3. 291-292 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kuno, A., Hasegawa, T.et al.: "Leucyl/Phenylalanyl(L/F)-tRNA-protein transferase-mediated N-terminal specific labeling to a protein in vitro."Nucleic Acids Research Supplement. 3. 259-260 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yokozawa, J., Hasegawa, T.et al.: "Molecular recognition of proline tRNA by prolyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 3. 247-248 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Hemmi, H., Hasegawa, T.et al.: "^1H, ^<13>C and ^<15>N chemical shift assignment of xylan-binding domain from Streptomyces olivaceoviridis E-86 β-xylanase."Journal of Biomolecular NMR. 27・1. 91-92 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ikeda, Y., Hasegawa, T.et al.: "Synthesis of novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo"Protein Engineering. 16・9. 699-706 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ito, S., Hasegawa, T.et al.: "Rational affinity purification of native Streptomyces family 10 xylanase."Journal of Biotechnology. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Kuno, A, Hasegawa, T. et al.: "Kinetics and binding mechenism of a family 13 xylan-binding domain from Streptomyces olivaceoviridis E-86."Mie Bioforum 2003 Proceeding. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Ito, S., Hasegawa, T.et al.: "Binding specificity of family13 carbohydrate binding module connected to Streptomyces family 10 xylanase."Mie Bioforum 2003 Proceeding. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Suzuki R, Hasegawa, T. et al.: "Mutagenic study of Streptomyces family 10 xylanase."Mie Bioforum 2003 Proceeding. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] Yokozawa, J., Nagaoka, Y., Umehara, T., Iwaki, J., Kawarabayasi, Y., Koyama, Y., Sako, Y., Wakagi, T., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Recognition of tRNA by aminoacyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 1. 117-118 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Fukuda, K., Sekiya, S., Kikuchi, K., Funaji, K., Kuno, A., Hasegawa, T., Nishikawa, S.: "Construction of the dual-functional RNA ligand against HCV protease and helicase."Nucleic Acisds Research Supplement. 1. 147-148 (2001)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Yokozawa, J., Umehara, T., Iwaki, J., Okamoto, K., Kawarabayasi, Y., Koyama, Y., Sako, Y., Wakagi, T., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Molecular recognition of threonine tRNA by threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 81-82 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Taki, M., Hahsaka, T., Murakami, H., Kuno, A., Hasegawa, T., Taira, K., Sisido, M.: "A novel fluorescent nonnatural amino acid that can be incorporated into a specific position of streptavidin."Nucleic Acids Research Supplment. 2. 225-226 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Iwaki, J., Asahara, H., Nagaoka, Y., Yokozawa, J., Umehara, T., Kawarabayasi, Y., Koyama, Y., Sako, Y., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Differences in tyrosine tRNA identity between Escherichia coli and archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 225-226 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kikuchi, K., FUkuda, K., Umehara, T., Hwang, J., Kuno, A., Hasegawa, T., Nishikawa, S.: "In vitro selection of RNA aptamers that bind to domain II of HCV IRES."Nucleic Acids Research Supplement. 2. 267-268 (2002)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Ishikura, K., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Evolution and tRNA recognition of threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Viva Origino. 31(1). 62-70 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kikuchi, K., Umehara, T., Fukuda, K., Hwang, J., Kuno, A., Hasegawa, T., Nishikawa, S.: "RNA aptamers targeted domain II of hepatitis CIRES could bind its apical loop region."Journal of Biochemistry. 133(3). 263-270 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kikuchi, K., Umehara, T., Fukuda, K., Hwang, J., Kuno, A., Hasegawa, T., Nishikawa, S.: "Structure-inhibition analysis of RNA aptamers that bind to HCV IRES."Nucleic Acids Research Supplement. 3. 291-292 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kuno, A., Taki, M., Kaneko, S., Taira, K., Hasegawa, T.: "Leucyl/phynylalanyl(L/F)-tRNA-protein transferase-mediated N-terminal specific labeling to a protein in vitro."Nucleic Acids Research Supplement. 3. 247-248 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Yokozawa, J., Okamoto, K., Kawarabayasi, Y., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Molecular recognition of proline tRNA by prolyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1."Nucleic Acids Research Supplement. 3. 247-248 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Hemmi, H., Kuno A., Ito, S., Kaneko, S., Hasegawa, T.: "^1H, ^<13>C and ^<15>N chemical shift assignment of xylan-binding domain from Streptomyces olivaceoviridis E-86 β-xylanase."Journal of Biomolecular NMR. 27(1). 91-92 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ikeda, Y., Kawahara, S., Taki, M., Kuno, A., Hasegawa, T., Taira, K.: "Synthesis of novel histidine analogue and its officient incorporation into a protein in vivo."Protein Engineering. 16(9). 699-706 (2003)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ito, S., Kuno, A., Suzuki, R., Kaneko, S., Kawabata, Y., Kusakabe, I., Hasegawa, T.: "Rational affinity purification of native Streptomyces family 10 xylanase."Journal of Biotechnology. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Kuno, A., Ito, S., Fujimoto, Z., Hemmi, H., Kaneko, S., Mizuno, H., Kusakabe, I., Hasegawa, T.: "Kinetics and binding mechenism of a family 13 xylan-binding domain from Streptomyces olivaceoviridis E-86."Mie Bioforum 2003 Proceeding. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Ito, S., Kuno, A., Kanno, Y., Suzuki, R., Kaneko, S., Kawabata, Y., Kusakabe, I., Hasegawa, T.: "Binding specificity of family 13 carbohydrate binding module connected to Streptomyces family 10 xylanase."Mie Bioforum 2003 Proceeding. (In press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Suzuki, R., Kuno, A., Ichikawa, T., Iwamatsu, S., Watanabe, M., Kaneko, S., FUjimoto, Z., Hasegawa, T.: "Mutagenic study of Streptomyces family 10 xylanase."Mie Bioforum 2003 Proceeding. (in press). (2004)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Ishikura, K., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Evolution and tRNA recognition of threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1"Viva Origino. 31・1. 62-70 (2003)
• [文献書誌] Kikuchi, K., Umehara, T., Fukuda, K., Hwang, J., Kuno, A., Hasegawa, T.: "RNA aptamers targeted domain II of hepatitis C IRES could bind its apical loop region"Journal of Biochemistry. 133・3. 263-270 (2003)
• [文献書誌] Kuno, A., Taki, M., Kaneko, S., Taira, K., Hasegawa, T.: "Leucyl/Phenylalanyl(L/F)-tRNA-protein transferase-mediated N-terminal specific labeling to a protein in vitro"Nucleic Acids Research Supplement. 3. 259-260 (2003)
• [文献書誌] Yokozawa, J., Okamoto, K., Kuno, A., Hasegawa, T.: "Molecular recognition of proline tRNA by prolyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon, Aeropyrum pernix K1"Nucleic Acids Research Supplement. 3. 247-248 (2003)
• [文献書誌] Hemmi, H., Kuno, A., Ito, S., Kaneko, S., Hasegawa, T.: "1H, 13C 15N chemical shift assignment of xylan-binding domain from Streptomyces olivaceoviridis E-86 β-xylanase"Journal of Biomolecular NMR. 27・1. 91-92 (2003)
• [文献書誌] Ikeda, Y., Kawahara, S., Taki, M., Kuno, A., Hasegawa, T., Taira, K.: "Synthesis of novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo"Protein Engineering. 16・9. 699-706 (2003)
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Hasegawa, T., et al.: "Molecular recognition of threonine tRNA by threomyl-tRNA synthetase from an extreme thermohilic archoen, Aeropyrum ptmix K1"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 81-82 (2002)
• [文献書誌] Taki, M., Hasegawa, T., et al.: "A novel fluorescent nonnatural amino acid that can be incorporated into a specific position of streptavidin"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 203-204 (2002)
• [文献書誌] Iwaki, J., Hasegawa, T., et al.: "Differences in tyrosine tRNA identity between Escherichia coli and archaeon, Aeropyrm permix K1"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 225-226 (2002)
• [文献書誌] Kikuchi, K., Hasegawa, T., et al.: "In vitro selection of RNA aptamers that bind to domain II of HCV IRES"Nucl. Acids Res. Suppl.. 2. 267-268 (2002)
• [文献書誌] Nagaoka, Y., Hasegawa, T., et al.: "Evolution and tRNA recognition of threonyl-tRNA synthetase from an extreme thermophilie archeaeon, Aeropyram pernix K1"Viva Origino. 31・1. 62-70 (2003)
• [文献書誌] Kikuchi, K., Hasegawa, T., et al.: "RNA aptamers fargeted domain II of hepatitis C IRES could bint its apical loop region"J. Biochem.. 133(in press). (2003)