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Rhoキナーゼの自己阻害機構の構造的基盤

研究課題

研究課題/領域番号 13680742
研究種目

基盤研究(C)

配分区分補助金
応募区分一般
研究分野 生物物理学
研究機関横浜市立大学

研究代表者

清水 敏之  横浜市立大学, 総合理学研究科, 助教授 (30273858)

研究分担者 箱嶋 敏雄  奈良先端科学技術大学院大学, 情報科学研究科, 教授 (00164773)
研究期間 (年度) 2001 – 2002
研究課題ステータス 完了 (2002年度)
配分額 *注記
3,600千円 (直接経費: 3,600千円)
2002年度: 1,400千円 (直接経費: 1,400千円)
2001年度: 2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
キーワードRhoキナーゼ / Rhoシグナリング / 自己阻害 / X線結晶構造解析 / 立体構造 / ERMタンパク質 / Merlin / FERMドメイン / Rho-キナーゼ / コイルドコイル / DHドメイン / Rho
研究概要

マウス由来のRhoキナーゼのキナーゼドメイン(一部コイルドコイル領域を含む)はSf9細胞を利用したバキュロウイルスの発現系によりタンパクを発現させ、精製した。その結果、純度の高い(95%以上)数mg程度の結晶化可能量を取得することに成功した。一般的に溶液が単分散系であれば結晶化する確率が高いことが知られているのでX線小角散乱法により溶液の分散状態を調べた。その結果、Rhoキナーゼの溶液は単分散系でありさらに四量体をとっていることが示された。この分子量の結果はゲルろ過により推定される結果と一致した。またマススペクトル、ペプチドシークエンサーにより予定通りの蛋白質を得ていることを確認した。この試料を幅広いpH、様々な沈殿剤・塩を含んだ結晶化スクリーン試薬を用いて結晶化条件を検討したが現在までのところ結晶は得られていない。現在のコンストラクトは前述のようにキナーゼドメインに加えコイルドコイルドメインがあるので、コイルドコイル領域を短くする、削るなどした別のコンストラクトの調整が必要であると思われる。
一方Rhoシグナリングと深く関わるERMタンパク質については、ICAM-2由来の細胞内領域のペプチドとの複合体構造の解析に成功した。さらにペプチド側のアミノ酸を変えることによる結合定数の変化を定量的に測定するためビアコアを用いた実験を行い、立体構造解析によって判明した種々の相互作用と様々な変異体実験がよく合致することを証明し立体構造の観点から認識機構を考察した。
またERMタンパク質と同様FERMドメインをもつがん抑制遺伝子産物Merlinの構造を決定し、臨床的に蓄積されていた様々な変異に関して立体構造の観点からどうして変異により機能を損失するのかを考察した。
さらにRho-RhoGDI複合体からRhoを解離させる作用がERMタンパク質に知られているが我々はRhoGDIとERMタンパク質との複合体の結晶化にも成功している。

報告書

(3件)
  • 2002 実績報告書   研究成果報告書概要
  • 2001 実績報告書
  • 研究成果

    (19件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (19件)

  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Crystallization and preliminary crystallographic studies of RhoGDI in complex with the radixin FERM domain"Acta Crystallogr. D57. 889-890 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Crystallographic characterization of the radixin FERM domain bound to the cytoplasmic tail of the adhesion protein ICAM-2"Acta Crystallogr. D57. 890-891 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Shimizu, T. et al.: "Structural basis for Neurofibromatosis Type 2 : Crystal structure of the Merlin FERM domain"J. Biol. Chem.. 277. 10332-10336 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Structural basis of adhesion-molecule recognition by ERM proteins revealed by the crystal structure of the radixin-ICAM-2 complex"EMBO J.. 22. 502-514 (2003)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 清水 敏之: "シグナル伝達分子の機能制御機構"蛋白質・核酸・酵素. 46. 1950-1955 (2001)

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      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] 清水 敏之: "がん抑制遺伝子産物Merlinの構造と機能"バイオサイエンスとインダストリー. 60. 537-538 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Shimizu, T.: "Auto-inhibition mechanism of proteins in signal transduction"PEN. 46. 1950-1955 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Shimizu, T.: "Structure and function relationship of the neurofibromatosis type 2 tumor suppressor gene product, Merlin"Bioscience & Industry. 60. 537-538 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hamada, K. et al: "Crystallization and preliminary crystallographic studies of RhoGDI in complex with the radixin FERM domain"Acta Crystallogr. D57. 889-890 (2001)

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      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Crystallographic characterization of the radixin FERM domain bound to the cytoplasmic tail of the adhesion protein ICAM-2"Acta Crystallogr., D57. 890-891 (2001)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Shimizu, T. et al.: "Structural basis for Neurofibromatosis Type 2: Crystal structure of the Merlin FERM domain"J. Biol. Chem., 277. 10332-10336 (2002)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Structural basis of adhesion-molecule recognition by ERM proteins revealed by the crystal structure of the radixin-ICAM-2 complex"EMBO J., 22. 502-514 (2003)

    • 説明
      「研究成果報告書概要(欧文)」より
    • 関連する報告書
      2002 研究成果報告書概要
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Structural basis of adhesion-molecule recognition by ERM proteins revealed by the crystal structure of the radixin-ICAM-2 complex"EMBO J.. 22. 502-514 (2003)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] 清水 敏之: "がん抑制遺伝子産物Merlinの構造と機能"バイオサイエンスとインダストリー. 60. 537-538 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Shimizu, T. et al.: "Strctural basis for Neurofibromatosis Type2:Crystal structure of the Mexlin FERM domain"J. Biol. Chem.. (in press). (2002)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Crystallization and preliminary crystallographic studies of RhoGDI in coaplex with the radizin FERM domain"Acta Crystallogr. D57. 889-890 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] Hamada, K. et al.: "Crystallographic characterization of the radixim FERM domain bound to the cytcplacmic taol of the adhesion protein ICAM2"Acta Crystallogr. D57. 891-892 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 清水: "転写因子の構造生物学"細胞工学. 20. 1359-1363 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書
  • [文献書誌] 清水: "シグナル伝達分子の機能制御機構"蛋白質・核酸・酵素. 46. 1950-1955 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書

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公開日: 2001-04-01   更新日: 2016-04-21  

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