| 研究課題/領域番号 |
13680906
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 一般 |
|---|
| 研究分野 |
実験動物学
|
|---|
| 研究機関 | 東北大学 |
|---|
研究代表者 |
高野 洋志 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (00241555)
|
|---|
| 研究分担者 |
菅原 稔 東北大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (20311558)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
|
| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
|
| 配分額 *注記 |
800千円 (直接経費: 800千円)
2002年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
|
|---|
| キーワード | マウス / インデューシブル・ジーンターゲティング / Cre組換え酵素 / タモキシフェン / 変異エストロジェンレセプター / PCNA / Cre組み換え酵素 |
|---|
| 研究概要 |
本研究の目的は、タモキシフェン-変異エストロジェンレセプター系を利用して、タモキシフェン投与によりマウス個体内の体細胞において遺伝子の不活化を誘導する、いわゆるインデューシブル・ジーンターゲティング法を確立することである。そのために、CreER^<T2>発現ベクターをPCNA遺伝子座にノックインし、増殖の活発な細胞においてCreの発現を誘導できるマウスの作製を試みた。
マウスPCNA遺伝子の第1イントロン内に設定したプライマーを用いて、マウスゲノムDNAよりPCRによりプローブを作製し、このプローブを用いて、マウスES細胞ゲノムライブラリーのスクリーニングを行い、4個のファージクローンを単離した。
これらのファージクロ-ンから、PCNA遺伝子のエクソン1を含むXbal-Sallフラグメントをサブクローニングし、CreER^<T2> cDNAを、PCNAとCreのATG開始コドンが一致するように、PCNAのATG開始コドンを含むエクソン1に導入した。また、CreER^<T2>の前にIRESを挿入した形のターゲティングベクターも作製した。いずれのターゲティングベクターも、5'側7.2kb、3'側1.3kbのPCNA遺伝子相同領域を付加した。
作製した2種類のターゲティングベクターは、エレクトロポレーション法により、J1マウスES細胞に導入し、295個のG418耐性ES細胞クローンを単離した。この内、64クローンよりDNAを抽出し、サザンブロット法により解析したところ、34クローンで、相同組換えにより、PCNA遺伝子座にCreER^<T2>が導入されていることが確認され、PCNA・CreER^<T2>ノックインES細胞の樹立に成功した。
|
