| 研究課題/領域番号 |
13680909
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
実験動物学
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
幸田 尚 東京工業大学, 遺伝子実験施設, 助手 (60211893)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
4,100千円 (直接経費: 4,100千円)
2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2001年度: 3,000千円 (直接経費: 3,000千円)
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| キーワード | Peg3 / 14-3-3 / two-hybrid system / protein binding / ゲノミックインプリンティング / zinc finger protein / 蛋白質相互作用 / インプリンティング / two hybrid / 母性行動 |
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| 研究概要 |
マウスPeg3遺伝子は父親から受け継いだアレルのみが発現するインプリンティング遺伝子である。この遺伝子はC2H2タイプのzinc finger proteinをコードし、マウスの母性行動や細胞のがん化、アポトーシスなどに重要な働きを持っている。
マウスPeg3をbaitとして用い、酵母のGAL4タンパク質を用いたtwo hybrid systemによりPeg3と結合するタンパク質のスクリーニングを行った。スクリーニングには、特にマウスの母性行動やグリオーマにおけるPeg3の働きを明らかにしてゆくことを念頭に、マウス脳のcDNAライブラリーを用いた。その結果、それぞれのbaitについて4x10^6のクローンのスクリーニングから10の候補遺伝子を得ることが出来た。これらの候補遺伝子をFlag-tagとのfusion蛋白質として、myc-tagを付加したPeg3とともにHeLa細胞に強制発現させた。これらのうちの1クローンは抗tag抗体を用いてPeg3を免疫沈降した場合に共沈すること、結合蛋白の側のtagで免疫沈降してもPeg3が共沈することがWestern blottingによって確認されたことから、Peg3蛋白質に結合することが証明された。塩基配列の解析から、このクローンはほぼ全長の14-3-3遺伝子をコードしていることが明らかとなった。
Peg3のアミノ酸配列の比較的N末側には14-3-3蛋白質に結合する蛋白質に共通するモチーフが存在しており、実際このモチーフの中で重要であると考えられているセリン残基をアラニンに変換した組み換え蛋白質を作成して免疫沈降の実験を行ったところ、Peg3の14-3-3 etaに対する結合能が失われたことから、14-3-3 etaとPeg3はこのモチーフを介して結合していることが明らかとなった。
14-3-3以外の候補遺伝子に関してはHeLa細胞で強制発現させた場合に可溶性蛋白質として抽出することが困難であり種々の方法で細胞内での結合を確認する実験を試みたが、細胞内での結合を検証することは出来なかった。
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