| 研究概要 |
本年度は,エストロゲンレセプターの分子結合部位を含むドメインをアルカリホスファターゼに挿入した融合タンパク質の機能・構造解析を行った.それらの遺伝子にランダム変異を導入し,エストロゲン様物質に対するセンサータンパク質のスクリーニングを行った.
(1)挿入型融合タンパク質の発現・精製および機能・構造解析
前年度に構築した10種類の挿入型融合タンパク質,すなわち,アルカリホスファターゼの立体構造上表面に位置する5つの部位(アミノ酸残基番号:189,250,315,360,408)に,2ないし11アミノ酸残基の2通りのリンカーを介して,エストロゲンレセプターを挿入したタンパク質を,それぞれ大腸菌内で発現したところ,すべて不溶性画分に存在した.それらを変性条件下で精製し巻き戻したタンパク質について,エストラジオール存在下および非存在下でホスファターゼ活性を測定したところ,すべて活性は検出できなかった.それらの円二色性測定を行ったところ,二次構造含量がかなり低下していたことから,タンパク質の巻き戻しが不十分であることが示唆された.
(2)センサータンパク質のスクリーニング
そこで,上記10種類の融合タンパク質にランダム変異を導入して,前年度に用意した,PVDF膜を用いたスクリーニング系を用いて,エストラジオール存在下でホスファターゼ活性を示すコロニーのスクリーニングを試みた.ランダム点変異の導入は,Error-prone PCR法で行った.このPCR産物を制限酵素で消化してベクターに連結し,挿入型融合タンパク質の変異体遺伝子ライブラリーを作製した.このライブラリーを大腸菌に導入したコロニーをPVDF膜に転写し,ホスファターゼ活性を示すコロニーをスクリーニングした.しかし,選択されたコロニーの活性は宿主由来のものばかりで,目的の変異体を得ることはできなかった.現在,スクリーニング系の改良を行っている.
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