| 研究課題/領域番号 |
13770362
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
循環器内科学
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
藤田 英雄 北里大, 医学部, 助手 (70327336)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
2,300千円 (直接経費: 2,300千円)
2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
2001年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 心筋収縮タンパク / トロポニン / アクチン / 遺伝子治療 |
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| 研究概要 |
アクチン遺伝子はpUC119にサブクローニングされている2.1kbのDictyostelium Discoideum Actin15全長遺伝子に対してsite-directed-mutagenesisを行っている。
本年度、意図したmutageneが得られず、さまざまな条件を変更し正しいシークンスを得るべく試行錯誤の状況である。まずはLA-PCR(long-accuracy PCR)によって直接mutagenesisを試みたが、伸長段階にてPCRエラーが多発するため、ターゲットのシークエンスをHind III, BglIIにてrestriction cutし、サブフラグメントに対してKunkel法によってmutagenesisを行ってintegrateする方法に変更する。また、PCRのanneal温度をやや低めに設定してあったので、stringencyを確保するためやや高温(68℃→72℃)に変更したり、伸長時間を長めに設定するなど細かい条件設定につき再検討を行っている。シークエンスが得られれば、プロモータとともにexpression vectorに挿入する予定である。本年度は以上のようにターゲット遺伝子を作成する段階での試行錯誤にとどまっており、結果を導くに至っていない。
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