| 研究概要 |
subtraction法を用いて,正常表皮細胞で発現しており先天性魚鱗癬様紅皮症(NBCIE)患者の表皮細胞では発現の低下あるいは消失している遺伝子を解析し,NBCIEの原因遺伝子を同定するために以下の研究を実施した。
1)魚鱗癬患者の皮膚生検組織から表皮細胞を分離,培養してmRNAを抽出した.
2)正常表皮細胞(Normal human epidermal keratinocyte; NHEK)を培養してmRNAを抽出した.
3)1)および2)で抽出したmRNAから,SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit(クローンテック社)を用いて,Reverse TranscriptionでcDNAを作った後に,LD-PCRを行って完全長のcDNAを多く含むcDNAをそれぞれ作成した.
4)3)で作成したcDNAについて,NHEK由来のcDNAをテスター,魚鱗癬由来のcDNAをドライバーとして,PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(クローンテック社)を用いてSubtractive Hybridizationを行いNHEKで発現の亢進が認められるcDNAを分離した.
5)4)で分離した,NHEKで発現の亢進が認められるcDNA(Subtracted cDNA)をTA Cloning VectorのpCR2.1(インピトロゲン社)に組み込み,Cell PORATORTM Electroporation System(ライフテックオリエンタル社)を用いて大腸菌Electromax DH10BTM Cellに導入した.
6)5)でSubtracted cDNAを導入した大腸菌クローンについて,予想される約104個のコロニーをナイロン膜にDuplicateして写し取り,それぞれのナイロン膜に2)で作った魚鱗癬由来のcDNAとNHEK由来のcDNAから作ったTotal cDNA Probeを用いてColony Hybridizationを行い,NHEKでしか発現の見られない,あるいはNHEKで発現の亢進が認められるクローンを同定した.
|
