フォンビルブランド因子特異的切断酵素のモノクローナル抗体を用いた精製と構造機能解析

• 研究課題/領域番号: 13770583
• 研究種目: 若手研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 血液内科学
• 研究機関: 奈良県立医科大学
• 研究代表者: 松本 雅則 奈良県立医科大学, 輸血部, 助手 (60316081)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 2,100千円 (直接経費: 2,100千円); 2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2001年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
• キーワード: フォンビルブランド因子 / VWF-CP / ADAMTS13 / フォンビルデランド因子 / VWF-CPase

研究概要

フォンビルブランド因子特異的切断酵素(VWF-CP)の精製をFujikawaらの方法をもとに改変し行った。蛋白精製の出発材料は有効期限切れの新鮮凍結血漿(fresh frozenplasma、FFP)である。これをDFPで処理し、その後lysin-sepharoseカラムを通して、まず血漿中のplasminogenを除去した。以後、硫安沈澱、butyl-sepharoseカラム、Q-sepahroseカラム、superdex200カラムにてVWF-CPを部分精製した。これを抗原として、マウスとウサギに免疫し、前者からはモノクローナル抗体を、後者からはポリクローナル抗体を作成した。モノクローナル抗体は、ELISAおよびウエスタンブロットでスクリーニングを行ったが、VWF-CPに特異的に反応するモノクローナル抗体は得られなかった。しかし、ポリクローナル抗体は、ウエスタンブロットでVWF-CPと強く反応し、また酵素活性を阻害することも確認した。阻害力価は、ポリクローナル抗体IgG 1mgあたり8.9 Bethesda Unitであった。なお、1 Betheda UnitはVWF-CP活性を50%阻害する力価である。今後、このポリクローナル抗体を用いVWF-CPを精製するか、遺伝子発現したVWF-CPを用いてマウスにするかして、再度モノクローナル抗体の作成を試みる予定である。

研究成果

• [文献書誌] Sugimoto M, et al.: "Mural thrombus generation in type 2A and 2B von Willebrand disease under high shear conditions"Blood. 101. 915-920 (2003)
• [文献書誌] Ashida A, et al.: "A successful treatment of a young infant who developed high-titer inhibitors against WWF-cleaving protease (ADAMTS13)"American Journal of Hematology. 71. 318-322 (2002)
• [文献書誌] Kokame K, et al.: "Mutations and common polymorphisms in ADAMTS13 gene responsible for von Willebrand factor-cleaving protease activity"Proceedings of National Academy Science USA. 99. 11902-11907 (2002)
• [文献書誌] Park Y-D, et al.: "Impaired activity of plasma von Willebrand factor-cleaving protease may predict the occurrence of hepatic veno-occlusive disease after stem cell"Bone Marrow Transplantation. 29. 789-794 (2002)
• [文献書誌] Mori T, et al.: "Predicting response to plasma exchange in patients with thrombotic thrombocytopenic purpura with measurement of WWF-cleaving protease activity"Transfusion. 42. 572-580 (2002)
• [文献書誌] Hayashi T, et al.: "Low-dosage intravenous immunoglobulin in the management of a patient with acquired von willebrand syndrome associated with monoclonal gammopathy of undetermined significance"Pathophysiology of Haemostasis and Thrombosis. 32. 33-39 (2002)
• [文献書誌] 松本雅則他: "血小板血栓形成の分子機構"アイプリユム. 407 (2002)
• [文献書誌] Ito M, et al.: "Complete amino acid sequence of kaouthiagin, a novel cobra venom metalloprotease with two disintegrin-like sequences"Biochemistry USA. 40. 4503-4511 (2001)
• [文献書誌] Kinoshita S, et al.: "Upshaw-Schulman syndrome revisited : A concept of congenital thrombotic thrombocytopenic purpura"International Journal of Hematology. 74. 101-108 (2001)
• [文献書誌] Yagi H, et al.: "Plasma of patients with Upshaw-Schulman syndrome, a congenital deficiency of von Willebrand factor-cleaving protease, enhances the aggregation of normal platelets under high shear stress"British Journal of Haematology. 115. 991-997 (2001)
• [文献書誌] Fujimura Y, et al.: "von Willebrand factor-cleaving protease and Upshaw-Schulman syndrome. In : Progress in Hematology"International Journal of Hematology. 75. 25-34 (2002)
• [文献書誌] Park Y-D, et al.: "Impaired activity of plasma von Willebrand factor-cleaving protease may predict the occurrence of hepatic veno-occlusive disease after stem cell transplantation"Bone Marrow Transplantation. (In press). (2002)
• [文献書誌] 藤村吉博 他: "血小板血栓形成の分子機構"アイプリコム出版社. 407 (2002)