| 研究課題/領域番号 |
13771039
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
眼科学
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
酒井 理恵子 自治医科大学, 医学部, 助手 (20316540)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
2,100千円 (直接経費: 2,100千円)
2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2001年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円)
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| キーワード | ヒト角膜内皮細胞 / CESP-1 / ヒスチジンタグ / cDNAライブラリー / GS3582 |
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| 研究概要 |
昨年度、ヒト正常角膜内皮細胞のcDNAプロファイルを作成した。この中で、角膜内皮細胞への発現数が多く特異性が高い未知遺伝子のクローニングを行い、Homo sapiens corneal endothelium specific protein 1(以下CESP-1)としてGenBankに登録した。今年度は、CESP-1の角膜内皮細胞における役割を追求するために、機能解析を行っている。
CESP-1は、一次構造から予想される特徴的なモチーフが存在しないため、以下の2つの方法で機能解析を進めている。
(1)立体構造の解析
CESP-1を大腸菌で大量発現させ、精製したものを結晶化することにより、その構造解析を行う。
・大腸菌によるCESP-1の発現系の構築
CESP-1をヒスチジンタグがN末端に付加されたpET-16bベクターに挿入した後、BL21(DE3)pLysS株に導入した。Isopropylthio-β-D-galactosideによる発現誘導を行い、大量培養を行った。ソニケーションによりタンパク質を抽出し、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロット法でCESP1の発現を確認した。
・CESP-1の精製
イオン交換クロマトグラフィーとヒスチジン吸着クロマトグラフィーを用いてCESP-1の精製を行った。さらにCESP-1を大量に精製し、そのサンプルをもとに結晶化による構造解析を行う。
(2)相互作用タンパク質の探索
ヒト角膜内皮細胞は入手が困難なため、ウサギを代用した。ウサギの角膜内皮細胞からtotal RNAを抽出し、既知の配列をもとに5'RACE法を行い、CESP-1に相当するウサギの遺伝子の全長をクローニングした。今後BacterioMatch^<TM>Two-Hybrid System XR cDNA Library Construction Kitを用いて、two-hybrid system法を行う予定である。
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