| 研究課題/領域番号 |
13780486
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| 研究種目 |
若手研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 研究分野 |
構造生物化学
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
玉腰 雅忠 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (10277254)
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| 研究期間 (年度) |
2001 – 2002
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| 研究課題ステータス |
完了 (2002年度)
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| 配分額 *注記 |
2,200千円 (直接経費: 2,200千円)
2002年度: 1,000千円 (直接経費: 1,000千円)
2001年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
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| キーワード | 進化工学 / フォールディング / 凝集体 / 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 耐熱性 |
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| 研究概要 |
大腸菌3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(IPMDH)を好熱菌IPMDHの代わりに好熱菌内で発現させると、高温では凝集体を形成するために56度以上では生育できない。しかし、56度でも生育可能となった好熱菌を突然変異により選択したところ、IPMDH遺伝子内にS106Iの変異が起きていた。その変異酵素は野生型大腸菌IPMDHと比べて耐熱性や触媒活性が低下していたものの、変性状態から希釈によるリフォールディングする能力が向上していた。この反応において濁度を測定したところ、濁度上昇が抑制された事から、S106I変異によりフォールディング過程における凝集体形成が抑制される事がわかった。本酵素は野生型酵素の結晶構造解析から、ホモダイマー構造のうち一つのサブユニットが大きく2つのドメインに分けられことがわかっている。そして片方のドメイン内にN、C両末端を含むため、フォールディング過程において複雑なトポロジー形成を必要とする。S106部位は、そのドメイン間の中間にあるヒンジ領域にあるが、この部位が置き換わる事により2つの末端を含むドメイン形成が容易になると考察される。
また、上記と同じ進化実験系によりS106I+M264Vの二重変異体が得られていた。このうち、M264Vの変異体を人為的に作製し、好熱菌内で発現させたところ、高温での生育はできなかった。したがってM264V変異は単独では凝集体形成の抑制には効果がなく、触媒活性や安定性に関わるものと考えられる。
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