汎用型不斉還元酵素モジュールの開発とキラルアルコール生産システムへの応用

• 研究課題/領域番号: 13853009
• 研究種目: 基盤研究(S)
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 応用微生物学・応用生物化学
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 清水 昌 京都大学, 農学研究科, 教授 (70093250)
• 研究分担者: 片岡 道彦 京都大学, 農学研究科, 助教授 (90252494) ; 小川 順 京都大学, 農学研究科, 助手 (70281102) ; 喜多 恵子 京都大学, 農学研究科, 教授 (70234226) ; 長谷川 淳三 鐘淵化学工業(株), 精密化学品研究部・精密化学品研究グループ, グループリーダー
• 研究期間 (年度): 2001 – 2005
• 研究課題ステータス: 完了 (2005年度)
• 配分額: 123,370千円 (直接経費: 94,900千円、間接経費: 28,470千円); 2005年度: 14,430千円 (直接経費: 11,100千円、間接経費: 3,330千円); 2004年度: 17,420千円 (直接経費: 13,400千円、間接経費: 4,020千円); 2003年度: 20,410千円 (直接経費: 15,700千円、間接経費: 4,710千円); 2002年度: 33,410千円 (直接経費: 25,700千円、間接経費: 7,710千円); 2001年度: 37,700千円 (直接経費: 29,000千円、間接経費: 8,700千円)
• キーワード: キラルビルディングブロック / カルボニル還元酵素 / 不斉還元 / 旧黄色酵素 / 不斉水素付加反応 / 木斉水素化反応 / キラルビルディングブロツク

研究概要

本研究では、様々なキラルアルコール類の生産プロセスに利用可能な「汎用型不斉還元酵素モジュール」の開発を目的に、各種カルボニル還元酵素に関する酵素化学的情報および遺伝子情報をもとに効率的な不斉還元システムの構築を目指して研究を進めてきた。
本研究を進めていく上で最も重要な点のひとつとして、基質特異性・立体選択性において多種多様なカルボニル還元酵素を取り揃える必要がある。スクリーニングにより、25種類の異なるカルボニル還元酵素を見出すことに成功している。これらに関して遺伝子クローニングを行い、15種類について塩基配列の決定に成功している。また、残りの10種類の酵素に関しても、遺伝子クローニングの途上にあり、おおよそ成功しつつある。塩基配列の決定に成功した15種類の還元酵素について、大腸菌での大量発現系の構築を行い、各酵素遺伝子の大量発現菌株を得ることに成功している。補酵素再生系酵素としては、Bacillus由来のグルコース脱水素酵素以外のものの探索を行った。副生物として容易に取り除ける炭酸ガスが生成する酵素、蟻酸脱水素酵素のスクリーニングを行った結果、Ancylobacter aquaticusより、NAD依存性の蟻酸脱水素酵素を見出した。
大腸菌での大量発現に成功しているカルボニル還元酵素15種に関して、補酵素再生系酵素であるグルコース脱水素酵素遺伝子との大腸菌内における共発現システムの構築を行った。それぞれの共発現大腸菌において、酵素活性が最も高く得られる培養条件や菌体処理条件の検討を行った。これらの検討により、不斉還元触媒として利用できる汎用型の生体触媒ライブラリーの構築に成功した。実際に、これらの菌体を触媒として、いくつかの基質への反応性を検討し、反応性や立体選択性の指標となる結果を得ている。

研究成果

• [雑誌論文] Gene cloning of an NADPH-dependent menadione reductase from Candida macedoniensis,and its application to chiral alcohol production. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Enzyme Microb.Technol. 38 ページ: 944-951
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A novel NADP^+-dependent L-1-amino-2-propanol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis MAK154 : A promising enzyme for the production of double chiral aminoalcohols. (2006)
  • 著者名/発表者名: M.Kataoka et al.
  • 雑誌名: Lett.Appl.Microbiol. (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Gene cloning of an NADPH-dependent menadione reductase from Candida macedoniensis, and its application to chiral alcohol production. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Enzyme Microb.Technol. 38 ページ: 944-951
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A novel NADP^+-dependent L-1-amino-2-propanol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis MAK154 : A promising enzyme for the production of double chiral aminoalcohols. (2006)
  • 著者名/発表者名: M.Kataoka et al.
  • 雑誌名: Lett.Appl.Microbiol. in press
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Microbial and enzymatic processes for the production of chiral compounds. (2006)
  • 著者名/発表者名: Honda, K. et al.
  • 雑誌名: Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnological Industries (ed by R.T.Patel) (Marcel Dekker, New York) (in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Gene cloning of an NADPH-dependent menadione reductase from Candida macedoniensis, and its application to chiral (2006)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M., et al.
  • 雑誌名: Enzyme Microb.Technol. 38・7 ページ: 944-951
• [雑誌論文] Old Yellow Enzymeの再発見:キラルインダストリーへの利用 (2006)
  • 著者名/発表者名: 片岡道彦他
  • 雑誌名: バイオサイエンスとインダストリー (印刷中)
  • NAID: 10017483893
• [雑誌論文] Whole organism biocatalysis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishige, T. et al.
  • 雑誌名: Curr.Opin.Chem.Biol. 9(2) ページ: 174-180
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Screening for Unique Microbial Reactions Useful for Industrial Applications. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, J. et al.
  • 雑誌名: Handbook of Industrial Biocatalysis (ed.by Ching T.Hou, Taylor, Francis, Boca Raton)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Whole organism biocatalysis (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishige, T., et al.
  • 雑誌名: Curr.Opin.Chem.Biol. 9・2 ページ: 174-180
• [雑誌論文] Expression of the Fusarium oxysporum lactonase gene in Aspergillus oryzae -molecular properties of the (2005)
  • 著者名/発表者名: Honda, K., et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 66・5 ページ: 520-526
• [雑誌論文] Practical resolution system for DL-pantoyl lactone using the lactonase from Fusarium oxysporum (2005)
  • 著者名/発表者名: Sakamoto, K., et al.
  • 雑誌名: J.Biotechnol. 118・1 ページ: 99-106
• [雑誌論文] Gene cloning and overexpression of two conjugated polyketone reductases,novel aldo-keto reductase family enzymes,of Candida parapsilosis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 64(3) ページ: 359-366
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cloning and overexpression of the old yellow enzyme gene of Candida macedoniensis,and its application to the production of a chiral compound. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: J.Biotechnol. 114(1-2) ページ: 1-9
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Gene cloning and overexpression of two conjugated polyketone reductases, novel aldo-keto reductase family enzymes, of Candida parapsilosis. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 64(3) ページ: 359-366
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Cloning and overexpression of the old yellow enzyme gene of Candida macedoniensis, and its application to the production of a chiral compound. (2004)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: J.Biotechnol. 114(1-2) ページ: 1-9
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Enzymes. (2004)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, J. et al.
  • 雑誌名: Bioprocesses and Biotechnology for Functional Foods and Nutraceuticals (ed.by J.-R.Neese, J.Bruce German, Marcel Dekker) (New York-Basel) ページ: 197-205
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Cloning and overexpression of the old yellow enzyme gene of Candida macedoniensis, and its application to the production of a chiral compound (2004)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: J.Biotechnol. 114・1-2 ページ: 1-9
• [雑誌論文] Gene cloning and overexpression of two conjugated polyketone reductases, novel aldo-keto reductase family enzymes, of Candida parapsilosis (2004)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 64・3 ページ: 359-366
• [雑誌論文] Biochemical and applied studies of microbial oxidoreductases (2004)
  • 著者名/発表者名: Delacruz-Hidalgo, A.-R.G. et al.
  • 雑誌名: 応用微生物学研究 2・1 ページ: 39-46
• [雑誌論文] Expression of the Fusarium oxysporum lactonase gene in Aspergillus oryzae-molecular properties of the recombinant enzyme and its application-. (2004)
  • 著者名/発表者名: Honda, K. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 66・5 ページ: 520-526
• [雑誌論文] 有用物質生産のための微生物プロセスの開発に関する基盤的研究 (2004)
  • 著者名/発表者名: 清水 昌
  • 雑誌名: 農化誌 78・1 ページ: 4-13
  • NAID: 10013139660
• [雑誌論文] Novel bioreduction system for the production of chiral alcohols. (2003)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 62(5-6) ページ: 437-445
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] The crystal structure and stereospecificity of levodione reductase from Corynebacterium aquaticum M-13. (2003)
  • 著者名/発表者名: Sogabe, S. et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 278(21) ページ: 19387-19395
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Production of a doubly chiral compound,(4R,6R)-4-hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanone,by two-step enzymatic asymmetric reduction. (2003)
  • 著者名/発表者名: Wada, M. et al.
  • 雑誌名: Appl.Environ.Microbiol. 69(2) ページ: 933-937
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Production of a doubly chiral compound, (4R, 6R)-4-hydroxy-2, 2, 6-trimethylcyclohexanone, by two-step enzymatic asymmetric reduction. (2003)
  • 著者名/発表者名: Wada, M. et al.
  • 雑誌名: Appl.Environ.Microbiol. 69(2) ページ: 933-937
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Old yellow enzyme from Candida macedoniensis catalyzes stereospecific reduction of C=C bond of ketoisophorone. (2002)
  • 著者名/発表者名: Kataoka, M. et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 66(12) ページ: 2651-2657
  • NAID: 110002693614
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Industrial microbial enzymes : their discovery by screening and use in large-scale production of useful chemicals in Japan. (2002)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, J. et al.
  • 雑誌名: Curr.Opinion Biotechnol. 13 ページ: 367-375
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Isolation and primary structural analysis of two conjugated polyketone reductases from Candida parapsilosis. (2001)
  • 著者名/発表者名: Hidalgo, A.-R.G.D.et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 65(12) ページ: 2785-2788
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Synthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by Escherichia coli transformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes. (2001)
  • 著者名/発表者名: Kizaki, N. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 55 ページ: 590-595
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Stereoselective reduction of alkyl 3-oxobutanoate by carbonyl reductase from Candida magnoliae. (2001)
  • 著者名/発表者名: Yasohara, Y. et al.
  • 雑誌名: Tetrahedron : Asymmetry 12 ページ: 1713-1718
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Cloning,sequence analysis,and expression in Escherichia coli of the gene encoding monovalent cation-activated Levodione reductase from Corynebacterium aquaticum M-13. (2001)
  • 著者名/発表者名: Yoshizumi, A. et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 65(4) ページ: 830-836
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Synthesis of optically pure ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by Escherichia coil transformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes. (2001)
  • 著者名/発表者名: Kizaki, N. et al.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 55 ページ: 590-595
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Vitamins and related compounds : microbial production. (2001)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, S.
  • 雑誌名: Biotechnology (Reed, G., Rehm, H-J. eds.) (VCH, Weinheim) vol.10 ページ: 320-340
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Cloning, sequence analysis, and expression in Escherichia coil of the gene encoding monovalent cation-activated Levodione reductase from Corynebacterium aquaticum M-13. (2001)
  • 著者名/発表者名: Yoshizumi, A. et al.
  • 雑誌名: Biosci.Biotechnol.Biochem. 65(4) ページ: 830-836
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnological Industries(ed by R.T.Patel) (2006)
  • 著者名/発表者名: Honda, K. et al.
  • 出版者: Marcel Dekker,New York(in press)
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Handbook of Industrial Biocatalysis(ed.by Ching T.Hou) (2005)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, J. et al.
  • 出版者: Taylor&Francis,Boca Raton
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Bioprocesses and Biotechnology for Functional Foods and Nutraceuticals(ed.by J.-R.Neese, J.Bruce German) (2004)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, J. et al.
  • 出版者: Marcel Dekker,New York-Basel
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [図書] Biotechnology(vol.10)(Reed,G., Rehm,H・J., eds.) (2001)
  • 著者名/発表者名: Shimizu, S.
  • 出版者: VCH,Weinheim
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Role of Acinetobacter calcoaceticus 3,4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids"Eur.J.Biochem.. 270. 486-494 (2003)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Biocatalytic department of a cetraxate ester by Microbacterium sp. strain 7-1W cells"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 67・1. 192-194 (2003)
• [文献書誌] 片岡道彦: "ラクトナーゼの機能解析と有用物質生産への応用"日本応用酵素協会誌. No.38. 19-27 (2003)
• [文献書誌] M.Kataoka et al.: "Novel bioreduction system for the production of chiral alcohols"Appl.Microbiol.Biotechnol. 62. 437-445 (2003)
• [文献書誌] M.Wada et al.: "Production of doubly chiral compound, (4R,6R)-hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanone, by two-step enzymatic asymmetric reduction"Appl.Environ.Microbiol.. 69・2. 933-937 (2003)
• [文献書誌] J.-Q.Liu et al.: "A novel enzyme, D-3-hydroxyasapartate aldolase from Paracoccus denitrificans IFO 13301 : purification, characterization, and gene cloning"Appl.Microbiol.Biotechnol.. 62. 53-60 (2003)
• [文献書誌] M.Kataoka et al.: "Old yellow enzyme from Candida macedoniensis catalyzes stereospecific reduction of C=C bond of ketoisophorone"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 66. 2651-2657 (2002)
• [文献書誌] 本田孝祐他: "化学品の製造に有用な生体触媒の探索と開発"ケミカル・エンジニアリング. 5月号. 345-351 (2002)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Purification and characterization of a novel esterase promising for t of useful compounds from Microbacterium sp.7-1W"FEMS Microbiol.Lett.. 206. 221-227 (2002)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Role of Acinetobacter calcoaceticus 3,4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids"Eur.J.Biochem.. 270. 486-494 (2003)
• [文献書誌] M.Wada et al.: "Production of a doubly chiral compound, (4R,6R)-4-hydroxy-2,2,6-trimethylcyclohexanone, by two-step enzymatic asymmetric reduction"Appl.Environ.Microbiol.. 69. 933-937 (2003)
• [文献書誌] M.Kataoka et al.: "Novel bioreduction system for the production of chiral alcohols"Appl.Microbial.Biotechnol.. (in press). (2003)
• [文献書誌] N.Kizaki et al.: "Synthesis of optically pure ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by Escherichia coli transformant cells coexpressing the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes"Appl.Microbiol.Biotechnol.. 55. 590-595 (2001)
• [文献書誌] Y.Yasohara et al.: "Stereoselective reduction of alkyl 3-oxobutanoate by carbonyl reducatse from Candida magnoliae"Tetrahedron : Asymmetry. 12. 1713-1718 (2001)
• [文献書誌] A.-R.G.D.Hidalgo et al.: "lsolation and primary structural analysis of two conjugated polyketone reductases from Canadia parapsilosis"Biosci.Biotechnol, Biochem.. 65(12). 2785-2788 (2001)
• [文献書誌] M.Kataoka et al.: "Glycolic acid production using ethylene glycol-oxidizing microorganisms"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65(10). 2265-2270 (2001)
• [文献書誌] S.Shimziu et al.: "Lactone-ring-cleaving enzymes of microorganisms : their diversity and applications"J.Biotechnol.. 92. 187-194 (2001)
• [文献書誌] K.Honda et al.: "Purification and characterization of a novel esterase promising for the production of useful compounds from Microbacterium sp.7-1W"FEMS Microbiol.Lett.. 206. 221-227 (2002)
• [文献書誌] S.Shimizu: "Blotechnology, vol.10"VCH, Weinheim. 850 (2001)