葉緑体in vitro RNAエディティング・翻訳共役系の確立

• 研究課題/領域番号: 13874111
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 植物生理
• 研究機関: 名古屋市立大学
• 研究代表者: 杉浦 昌弘 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 教授 (80027044)
• 研究分担者: 谷本 英一 名古屋市立大学, 大学院・システム自然科学研究科, 教授 (90080283)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2003
• 研究課題ステータス: 完了 (2003年度)
• 配分額: 2,400千円 (直接経費: 2,400千円); 2003年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2002年度: 800千円 (直接経費: 800千円); 2001年度: 800千円 (直接経費: 800千円)
• キーワード: 葉緑体 / in vitro系 / RNAエディティング / 翻訳 / タバコ / エンドウ / mRNA / in vitro 系 / RNA エディティング

研究概要

高等植物の葉緑体の転写産物では、CからUへのRNAエディティングにより一部の配列が変化する。その中で、ACGがAUGに変化して翻訳開始コドンを生じる。このエディティングから翻訳開始までの分子機構を解析する手法としてRNAエディティングと翻訳を連動して行うin vitro系の開発のため以下の研究を行った。
1.In vitro系の改良
昨年度は葉緑体in vitroRNAエディティング系の大幅な改良を行ったが、この系はP32標識mRNA基質を用いる。この基質調製が煩雑なため、より簡単な非アイソトープ法の開発を行った。蛍光標識ダイデオキシヌクレオチドとプライマー伸長法を組み合わせ効率よくアッセイできる手法が出来上がった。一方の、in vitro翻訳系の方も非アイソトープ化を進め、蛍光タンパク質mRNAを目的の葉緑体mRNAの後方に結合させ、翻訳産物を蛍光強度でアッセイする手法も完成した。上記の両in vitro系を一緒にして、RNAエディティングと翻訳の共役系の確立をめざしたが、両系の調製液の組成と反応組成が異なるため、充分活性のある共役系がまだ得られていない。
2.In vitro系に適した植物種の探索
一貫して最も解析の進んでいるタバコを使用してきたが、エンドウ葉緑体よりin vitroRNAエディティング系の開発をしたが、RNアーゼ活性が高いため、in vitro翻訳系の開発には適していないことが明らかになった。そこでキュウリ葉緑体についてin vitro系開発の適合性の調査を行ったが、充分な結果を出すまでには得られなかった。

研究成果

• [文献書誌] Sugiura, M.: "History of chloroplast genomics."Photosynthesis Research. 76. 371-377 (2003)
• [文献書誌] Hasegawa, K.: "A tRNA^<Lew>-like sequence located immediately upstream of an Arabidopsis clock-regulated gene is transcriptionally active."Gene. 307. 133-139 (2003)
• [文献書誌] Nakamura, T.: "Array-based analysis on tobacco plastid transcripts : preparation of a genomic microarray containing all genes and al intergenic regions."Plant Cell Physiology. 44. 861-867 (2003)
• [文献書誌] Cloix, C.: "In vitro analysis of sequences required for transcription of the Arabidopsis thaliana 5S rRNA genes."Plant Journal. 35. 251-261 (2003)
• [文献書誌] Miyamoto, T.: "A site-specific factor interacts directly with its cognate RNA editing site in chloroplast transcripts."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 101. 48-52 (2004)
• [文献書誌] Hirose, T.: "Functional Shine-Dalgarno-like sequences for translational initiation of chloroplast mRNAs."Plant Cell Physiology. 45. 114-117 (2004)
• [文献書誌] Yukawa, Y.: "In vitro transcription system from BY-2 cells. In "Biotechnology in Agriculture and Forestry", vol."BY-2 Cells""Springer. (2003)
• [文献書誌] Miyamoto, T.: "Recognition of RNA editing sites is directed by unique proteins in chloroplasts"Mol. Cell. Biol.. 22. 6726-6734 (2002)
• [文献書誌] Hasegawa, K.: "Organization and transcription of the gene family encoding chlorophyll a/b-binding proteins in Nicotiana sylvestris"Gene. 289. 161-168 (2002)
• [文献書誌] Mathieu, O.: "5S rRNA genes expression is not inhibited by DNA methylation in Arabidopsis"Plant Journal. 29. 313-323 (2002)
• [文献書誌] Hasegawa, K.: "In vitro analysis of transcription initiation and termination from the Lhcb1 gene family in Nicotiana sylvestris"Plant Journal. 33. 1063-1072 (2003)
• [文献書誌] Sasaki, T.: "Identification of RNA sites in chloroplasts transcripts from the maternal and paternal progenitors of tobacco(Nicotiana tabacum)"Mol. Biol. Evol.. (2003)
• [文献書誌] Plader, W.: "The Shine-Dalgarno-like sequence is a negative regulatory element for translation of tobacco chloroplast rps2 mRNA"Plant Journal. (2003)
• [文献書誌] 杉浦昌弘: "生体の科学 第53巻(2号)p124-130 「RNAエディティングに関与するタンパク-クロロプラストの例"医学書院. (2002)
• [文献書誌] Hirose, T.: "Involvement of a site-specific trans-acting factor and a common RNA-binding protein in the editing of chloroplast mRNAs"EMBO J.. 20. 1144-1152 (2001)
• [文献書誌] Arnaud, P.: "Analysis of the SINE S1 Pol III promoter from Brassica"Plant Journal. 26. 295-305 (2001)
• [文献書誌] Tsudzuki, T.: "Comparative analysis of RNA editing sites in higher plant chloroplasts"J. Mol. Evol.. 53. 327-332 (2001)
• [文献書誌] Wakasugi, T.: "The genomics of land plant chloroplasts : Gene content and alternation of genomic information by RNA editing"Photosynthesis Res.. 70. 107-118 (2001)
• [文献書誌] Yukawa, Y.: "A tobacco nuclear extract supporting transcription, processing, splicing and modification from plant intron-containing tRNA precursors"Plant Journal. 28. 583-594 (2001)
• [文献書誌] Nakamura T.: "Chloroplast ribonucleoproteins function as a stabilizing factor of ribosome-free mRNAs in the stroma"J. Biol. Chem.. 276. 147-152 (2001)