| 研究概要 |
Blue-green algae Synechocystis sp. (ATCC 27184)より、インテインの介在が報告されているdna-Eおよびdna-B遺伝子をダイレクトPCR法により獲得した。本戦略に必要のない、エンドヌクレアーゼ活性を有する配列(インテイン中に含まれる)を欠失させた。それぞれ、2つに分断した(N-,C-intein)。リグニンペルオキシダーゼ(LiP H8)のcDNAは3つに分断し、lip-(Ala1-Ala161), lip-heme(Glu168-Ala271), lip-C(Asp268-Ala343)とした。
プラスミドの調製のため、LiP cDNAとdna-inteinのライゲーションはギャップ補填法で行った。pET-23aベクターに組み込み、大腸菌を宿主として発現させた。
予備実験として、Lip-hemeタンパク質の、ヘムとの配位を伴った巻き戻しを行い、良好な結果を得た。これまでにない高効率ヘム酵素発現系構築に期待が持たれる。最終的なNMR解析は^<13>C-NMRおよびHSQC、HMBC、HOHAHAにより行う。lip-Cタンパク質のみを^<13>Cラベルすることで、1,900程度あるシグナルを575に単純化し、これまで不可能であった詳細な構造解析が可能となる。現在、構築した3つのプラスミドを用いて、3つに分断したLiPタンパク質を獲得し、そのタンパク質スプライシング条件の最適化を検討している。引き続き検討を行っていく。
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