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脂質性ドメイン解析のための急速凍結・免疫電顕法の開発

研究課題

研究課題/領域番号 13877003
研究種目

萌芽研究

配分区分補助金
研究分野 解剖学一般(含組織学・発生学)
研究機関名古屋大学

研究代表者

藤本 豊士  名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (50115929)

研究期間 (年度) 2001 – 2003
研究課題ステータス 完了 (2003年度)
配分額 *注記
1,600千円 (直接経費: 1,600千円)
2003年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2002年度: 500千円 (直接経費: 500千円)
2001年度: 600千円 (直接経費: 600千円)
キーワード脂質滴 / 急速凍結 / ADRP / 凍結割断レプリカ / Nile red / Sudan III / 脂肪滴 / 膜ドメイン / 超微形態 / 免疫電顕 / 極低温電子顕微鏡
研究概要

脂質滴は内部にコレステロールエステルとトリグリセリドを貯蔵し,外周は燐脂質とフリーコレステロールでできた脂質一重層で覆われている構造である.前年度までの研究により、脂質滴の微細構造は通常の化学固定では保持されないことが確認された.今年度は,従来の急速凍結法を改良し,脂質滴構造を生きた状態のまま高度に保持し,脂質滴構造蛋白質の局在を詳細に明らかにするための方法を確立した.
多数の脂質滴を内在性に持つHepG2細胞などの培養細胞を用い,PBSに溶解した10%BSAでリンスしたのち,少量の同液中で機械的に剥離し,短時間の遠心でペレットにした.Leica社製の加圧急速凍結装置EM-PACTの平板凹型の試料台(底部に小孔があり,底部から加圧されるもの)に1-2ulのペレットをいれ,10um厚の銅板を載せて,試料ポッドに規定の圧力で固定し,急速凍結した.ついでBAL-TEC社製の真空凍結割断装置BAF400にて-115℃で割断し,白金・カーボンレプリカを作製した.常温に戻した試料台からレプリカの付着した細胞ペレットを回収し,2.5%SDS in PBS中で60℃,15分処理した.洗浄後,100u/ml DNase Iで37℃,一晩消化し,さらに25%SDS in PBS中で60℃,15分処理してSDS-FRL法による抗体標識に供した.
上記の方法により氷晶のない試料のレプリカがコンスタントに得られ,脂質滴は膜内粒子のない平滑な割断面を持つ球として認められた.またADRPは凹面として割れた脂質滴に一面に,また脂質滴を横断するように割れた割断面の円周から一定の距離を持つ標識として観察された.今回の方法は,脂質滴だけでなく,化学固定が困難な他の構造にも応用可能であると考えられる.

報告書

(3件)
  • 2003 実績報告書
  • 2002 実績報告書
  • 2001 実績報告書
  • 研究成果

    (5件)

すべて その他

すべて 文献書誌 (5件)

  • [文献書誌] Nakamura, N., Fujimoto, T.: "Adipose-differentiation-related protein has two independent domains for targeting to lipid droplets."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 306. 333-338 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] Aoki, T., Kogure, S., Kogo, H., Hayashi, Y., Ohno-Iwashita, Y, Fujimoto, T.: "Sequestration of cross-linked membrane molecules to caveolae in two different pathways."Acta Histochem.Cytochem.. 36. 165-171 (2003)

    • 関連する報告書
      2003 実績報告書
  • [文献書誌] Tauchi-Sato, K., S.Ozeki, T.Houjou, R.Taguchi, T.Fujimoto: "The surface of lipid droplets is a phospholipid monolayer with a unique fatty acid composition"J. Biol. Chem.. 277. 44507-44512 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] Fukumoto, S., T.Fujimoto: "Deformation of lipid droplets in fixed samples"Histochem. Cell Biol.. 118. 423-428 (2002)

    • 関連する報告書
      2002 実績報告書
  • [文献書誌] 藤本 豊士: "細胞膜ドメインの構造と機能"細胞. 33. 22-27 (2001)

    • 関連する報告書
      2001 実績報告書

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公開日: 2001-04-01   更新日: 2016-04-21  

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