遺伝子変異をもちいた呼吸調節のメカニズムの解析

• 研究課題/領域番号: 13877253
• 研究種目: 萌芽研究
• 配分区分: 補助金
• 研究分野: 麻酔・蘇生学
• 研究機関: 千葉大学
• 研究代表者: 西野 卓 (2002) 千葉大学, 医学部・医学研究院, 教授 (80009703); 浅野 秀文 (2001) 千葉大学, 大学院・医学研究院, 助手 (80251156)
• 研究分担者: 西野 卓 千葉大学, 大学院・医学研究院, 教授 (80009703)
• 研究期間 (年度): 2001 – 2002
• 研究課題ステータス: 完了 (2002年度)
• 配分額: 2,300千円 (直接経費: 2,300千円); 2002年度: 1,100千円 (直接経費: 1,100千円); 2001年度: 1,200千円 (直接経費: 1,200千円)
• キーワード: 低酸素応答 / 遺伝子発現 / GFP / 細胞株 / 低酸素 / 応答 / 遺伝子 / エリスロポイエチン / エンハンサー / プロモーター / 発現

研究概要

酸素は生体にとって必須のものであり低酸素状態においてはこれを克服するため様々な応答をする。これらは個体、各臓器、構成する細胞の応答と細分化することができるが、逆に細胞を用いた研究からの知見を臓器、個体へと還元し臨床応用可能なものへと発展させることが可能であろう。このような観点から我々は培養細胞を用いて研究を行っている。この際、細胞の低酸素応答が生きたまま目で見ることができれば有用であろうと考えそのような細胞の作成を試みてきた。応答の可視化のためには緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いている。これはクラゲ由来のタンパク質で、この遺伝子を人為的に発現させるとそのタンパク質をもつ細胞は蛍光下に緑色に光る。我々はその発現を低酸素に対する遺伝子応答と関連させた。
【方法】血管内皮増殖因子の遺伝子発現調節領域にある低酸素誘導因子の結合モチーフを合成し5個繰り返したものを作成、エンハンサーとした。またCMVプロモーターより最小機能単位をPCR法により増幅しプロモーターとした。これらがEGFPのcDNAの上流に位置するよう組み込まれたコンストラクトを作成しHeLa細胞に導入した。さらに薬剤による選択を行い、二つの細胞株を樹立した。
【結果】これらの細胞は2%酸素下に半日から一日培養すると、蛍光顕微鏡下に緑色に光る。その後20%酸素下に数日培養することにより元に戻る。この反応は繰り返すことができ、また、凍結保存、解凍、培養、再度の実験が可能であった。4%酸素下ではこの応答は観察されない。定量性については検討中である。