| 研究概要 |
実験方法
1)片眼を1%トロピカミド点眼にて散瞳した.ブラウンノルウェーラット、メス、体重120-200gのラットにケタミン11mg/kg、キシラジン14mg/kgを腹腔内注射し、全身麻酔施行。
2)全麻下で網膜光凝固、Krypton red laser(647nm)、100μm、0.1s、120mW、で後極部に10発施行し、脈絡膜新生血管を誘発し、脈絡膜新生血管モデルを作成。
3)眼底写真、フルオレセイン蛍光眼底造影(FAG)は眼底カメラで1日、3日、1週、2週、1月、2月、3月、4月、5月、6月後に施行。
4)組織学的検討は1週、2週、1月、3月、6月後に、ラットにペントバルビタールを大量投与後、眼球を摘出し、メチルカルノアにて固定。パラフィン包埋し、2μmの厚さの切片を作成。切片はヘマトキシリン染色と抗RECA-1(rat endothelial cell antigen)による免疫染色を行い、血管新生の経時的変化を観察。
5)眼球摘出後網膜を分画し網膜のタンパクを抽出する。サンプルはコントロール、レーザー施行後3日、1週、2週、1月、3月、6月後の眼球から抽出。12.5%のアクリルアミドゲルを作成し、各10μgずつ電気泳動。ニトロセルロースメンブレンを使用しWestern blottingを施行。一次抗体にはanti-ChM-1 antibody(Haruko Funaki, IOVS 42:1193-1200,2001)を1:1000で使用し、二次抗体にはEnvison+Rabbit/HRP(DAKO)を1:1000で使用した。
6)1)と同様の全麻下で、手術用顕微鏡下にて耳上側の結膜を切開し、強膜を露出。30G針で強膜を擦り脈絡膜をわずかに露出し、30G針を網膜下に挿入する。ハミルトンシリンジ、ハミルトンリピーティングディスペンサーを使用し、Green flourescein protein(GFP)発現ベクター(C-Terminal Fluorescnent Protein Vector pEGFP-C1,Clontech lab)を5μ1(20μg)を網膜下に注入。注入後3日、5日、1週後に、Scanning laser ophthalmoscope(SLO)にてGPF発現を観集。
7)ChM-1のcDNAを導入したpCNX2高発現プラスミドベクターを精製し、10mM Tris-HCl(0.14M Nacl含)pH8.0、濃度3.73mg/mLに調整し、網膜下に注入し、レーザー光凝固で誘発された2週から1月後の脈絡膜新生血管に対する効果をコントロールと比較検討中。
結果および考察
1)RECA-Iを使用した免疫組織染色でも1週後よりレーザー光凝固部に抗体で染色される新生血管内皮細胞が確認された。しかし、レーザー部位により所見に差があり、新生血管の確認できない部位もあった。以後3月後まで新生血管の進展、成長が確認できた。
2)コンドロモジュリン-Iはレーザー光凝固施行3日後より減少し、1月後までほぼ不変で、3月後から少しずつ増加した。このことは血管新生抑制因子であるコンドロモジュリン-Iが減少することにより新生血管が発生し、3月後くらいから抑制因子が回復・増加してきて、6月後くらいから新生血管が萎縮・消退するという関係が示唆される.
3)GFP発現ベクターの注入によるGFP産生がSLOで蛍光発色として明確に認められなかった。うまくいかない原因として、GFPが産生されているものがかなり少ない。注入量が少ない。網膜下にただ注入しただけでは導入できない。などが考えられる。今後、電気泳動法の併用などを検討中。
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